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细胞色素P450(Cytochrome P450)是一类血红素氧化酶,它在细菌、动物和植物中普遍存在。CYP450在生物细胞中通过可逆性变化而进行电子传递,参与多种重要的生物代谢过程。在真核生物中,作为一种膜结合蛋白,CYP450主要分布在内质网、微粒体和线粒体内膜上。植物CYP450具有广泛的催化活性,其功能可归为参与生物合成途径和参与生物解毒途径两大类。以往的研究表明,CYP450可能参与野生茄子托鲁巴姆对黄萎病菌防卫反应过程,但其功能仍有待研究。本研究从大丽轮枝菌诱导的托鲁巴姆差异表达cDNA文库中挑选CYP51和CYP77A2片段作为研究对象,采用同源克隆法扩增这两个基因,通过遗传转化再生CYP51和CYP77A2转基因烟草植株,进一步对转基因植株的黄萎病抗性进行了鉴定。结果如下：StCYP51基因的克隆与分析。采用RT-PCR方法,扩增得到了StCYP51基因的编码序列。StCYP51基因ORF长度为1464bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,cDNA编码一个由487个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量为55.33kDa,理论等电点为8.35。为了分析StCYP51的功能,构建了pCB2008E-StCYP51过表达载体。采用农杆菌介导法将StCYP51基因转入烟草NC89中,共得到潮霉素抗性烟草14个株。Southern杂交检测显示,一个株系有杂交信号,显示为单拷贝。在转基因株系中StCYPS1的mRNA水平明显高于野生型对照。对转StCYP51基因植株的黄萎病菌抗性进行了分析,其病情指数和发病率分别为52.78和88.79%,低于对照的77.78和100%。StCYP77A2基因的克隆与分析。采用RT-PCR的方法,扩增得到了StCYP77A2的编码序列。StCYP77A2基因ORF长度为1536bp,起始密码子为ATG;终止密码子为TAA。该cDNA编码一个由511个氨基酸残基组成的蛋白。蛋白分子量为58.08kDa,理论等电点为9.17。为了分析StCYP77A2的功能,构建了pCB2008E-StCYP77A2过表达载体。采用农杆菌介导法将StCYP77A2基因转入烟草NC89中,共得到潮霉素抗性烟草11个株。Southern杂交检测显示,两个株系有杂交信号,皆为双拷贝。在转基因株系中StCYP77A2的mRNA水平均明显高于野生型对照。对转StCYP77A2基因植株的黄萎病菌抗性进行了分析,其病情指数和发病率分别为33.33和33.33,低于对照的77.78和100%。