PGPR菌株N2106在小麦根部的吸附机理和定殖动态

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对小麦根际促生细菌AzotobacteT N2106进行抗生素抗药性试验,发现N2106对Str具有抗性,对Tc敏感,通过三亲本杂交将发光酶基因luxAB导入菌株N2106,获得的标记菌株N2106-L具有发光活性和对Km、Str、Tc三种抗生素的抗性,转移频率为(3.72±0.23)×10-5。将标记菌株连续传代15次,在LB平板上和含有3种抗生素的LB平板上,作影印对比点种试验,发现luxAB基因标记的丢失率为9.8%,表明标记菌株具有较好的遗传稳定性。采用碱裂解法提取N2106-L中的质粒,证明pTR102质粒已成功地转移到N2106菌株中,N2106-L菌株的生理生化特性并没有受到luxAB基因导入的影响,同时测定出发菌株N2106和标记菌株N2106-L的生长动力学曲线,发现菌株N2106-L的生长没有受到外源质粒的影响,用N2106-L代替N2106进行生态学研究是可行的。   采用石油醚和丙酮脱脂、甲酸抽提、硫酸铵盐析、热处理、甲壳素亲和层析的方法分离纯化麦胚凝集素(WGA),从小麦胚中纯化的WGA的纯化倍数为115.9,血凝活力为6.8 mg/L,产率为0.566 mg/g。WGA的糖结合试验表明,它的血细胞凝集活性可以部分地被D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-果糖、蔗糖、N2106的胞外多糖和荚膜多糖所抑制,推测WGA可能影响定殖在小麦根际的促生细菌。为检测WGA与其它根际细菌的亲和性识别作用,用Marshall法对纯化的WGA进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记,用标记的麦胚凝集素对水稻和棉花根际细菌染色,发现水稻和棉花根际细菌与FITC标记的麦胚凝集素的阳性结合率分别为86.5%和5%。表明麦胚凝集素对不同的根际细菌具有不同的特异性识别作用。   为研究细菌的荚膜多糖提取物对菌体的保护作用,将有荚膜和去荚膜的N2106-L细菌细胞置于极端环境下进行成活率对比实验。结果,有荚膜的细菌细胞、无荚膜的细菌细胞、冷冻前添加荚膜多糖提取物的无荚膜细菌细胞经-34℃处理3d后,成活率分别为9.1%、2.1%、4.0%。三种类型的细菌细胞在完全干燥情况下培养7d后,成活率分别为3.2%、2.1%、2.7%。实验结果表明N2106-L的荚膜多糖提取物在一定程度上保护了细菌免受低温冷冻、干燥等极端环境的损伤。   细菌稳定吸附到小麦根部是PGPR在植物根部成功定殖的关键环节。将N2106-L和小麦共培养,研究了细菌对植物根的附着、吸附动力学及等温吸附。稳定吸附发生在N2106-L菌株与小麦幼根接触的瞬间,1min时,吸附量达到3.04×107CFU/g,在吸附的前60min内,吸附量呈线性增加(yⅡ=0.009x+7.5215(R2=0.9713)),以后逐渐达到最大值,增加到1.24×108CFU/g。从N2106-L的吸附动态曲线可以看出,其吸附规律符合Langmuir吸附等温线。经计算,N2106-L在小麦根表的最大饱和吸附量qm=1.67x 10<8>/g,吸附系数a =2.17x10<-9>。有英膜细胞的吸附量是去英膜细胞吸附量的4.1倍(p=0.01),新鲜培养的细胞与幼根相互作用更活跃,表明细菌的英膜在细菌和幼根的相互识别中也发挥了重要作用。添加WGA浓度至0.2mg/ml时,吸附量比对照增加了42% (p=0.01),当小麦幼根用胞外多糖和英膜多糖提取物预处理后,吸附量比空白对照各下降了71%和48%勿=0.01)。   以EUB338-cy3为探针,应用FISH技术监测了N2106-L在纯培养的小麦根表的空间分布,明显可见N2106-L在小麦根表的生物膜,而且清晰地观察到大量菌体吸附到小麦根毛和根表,且沿根表细胞纵向分布。将标记菌株接种到灭菌和非灭菌的黄褐土、红壤和黄潮土中研究其存活状况,发现N2106-L在灭菌和非灭菌的三种土壤中均能长期存活,并具有与土著菌株进行空间和营养竞争的能力;在灭菌土壤中的数量稍高于非灭菌土壤;在三种土壤中的数量依次为:黄褐土>黄潮土>红壤。   采用根盒试验追踪标记菌株在小麦根圈的定殖动态,发现N2106-L在小麦根表定殖密度大于根际定殖密度。在小麦根际,小麦播种10d时标记菌株在0-2cm深度根际土壤定殖达到最大值((2.17t0.25)x lO6CFLJ/g土,20d时在2-4cm深度的根际土壤中达到最高定殖水平((3.9210.47)x 105 CFU/g土;在小麦根表,标记菌株在小麦播种lOd时在所有深度的根段均达到最高定殖水平,0-2cm根段定殖密度为((3.6010.60)x106CFU/g鲜根,12cm以下根段达到((2.7810.56)x104CFLJ/g鲜根。结果表明标记菌株随着根的伸长不断向根尖方向扩散,且较为稳定地在小麦根圈定殖,但并不与根的生长同步,而是稍迟于根的生长。在小麦生长前期养分供应充足,接种菌株在所有根段无论根际还是根表其定殖数量均呈上升趋势,以后随着营养物质的消耗、代谢产物的积累等原因导致菌群数量下降。
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