膀胱癌是我国泌尿系统最常见的肿瘤。肿瘤的发生与癌基因的激活及抑癌基因的失活有关。公认的观点是：抑癌基因的失活由基因的突变引起，但目前研究显示抑癌基因甲基化亦是其失活的重要机制之一。甲基的引入使基因的空间结构改变，影响DNA与蛋白质分子的结合，导致基因转录失活，表达受抑制，并且可能出现突变或癌变，其甲基化常集中在基因启动子。启动子区域CpG岛过甲基化已在肿瘤细胞中得到证明，而在正常组织细胞中，此区域常处于非甲基化状态。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化完成的，在人类细胞中，DNA甲基化过程与DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferasel，DNMT1)密切相关，它的表达直接影响着DNA甲基化状态。 RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术是最近广泛用于抑制基因表达的新技术，主要用于基因功能和基因治疗学等方面的研究。目前国内尚未见运用siRNA沉默膀胱癌细胞DNMT1表达的相关文献报道。本研究首先运用RT-PCR检测膀胱癌和正常组织DNMT1存在RNA表达水平差异，证实在膀胱癌中存在DNMT1的过表达；接着应用RNAi技术，将针对DNMT1的siRNA转染入膀胱癌T24细胞内，荧光显微镜下证实转染效率达90％以上，分别运用RT-PCR及Western-blot检测转染后DNMT1基因转录水平及蛋白表达水平均得到下调，下调程度随着时间的增长而增强；并运用MTT实验及流式细胞术测周期及凋亡发现转染siRNA后能有效抑制T24细胞增殖，促进细胞凋亡。从而为膀胱癌的临床基因治疗在分子水平及细胞水平提供新的理论基础。 第一部分DNMT1在膀胱癌中的表达及其意义 材料与方法： 1.1、标本来源 20份膀胱癌标本取自中山大学附属第二医院泌尿外科2002年11月2日～2007年10月28日手术切除的膀胱癌患者。男17例，女3例。年龄46～76岁，平均年龄58岁。病理分级按WHO标准，G1 3例，G2 11例，G3 6例；临床分期按UICC的TNM标准，其中表浅性癌Tis～T1期3例、浸润性癌T2～T4期17例。本组盆腔淋巴结转移3例。膀胱癌患者正常膀胱粘膜组织标本20例作为对照。标本均为术中切取，迅速置入液氮中，再转入-80℃冰箱保存备用。 1.2、实验方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)采用RT-PCR检测20例膀胱癌、20例正常膀胱粘膜中DNMT1 mRNA的表达情况，并对PCR扩增结果采用半定量分析。 1.3、统计学分析 用SAS8.1统计软件进行分析，用t检验，以α=0.05作为检验水准。 结果： RT-PCR结果DNMT1在膀胱癌组织与正常对照组中表达值分别为0.951.±0.137，0.729±0.116(T=4.78，P=0.01)，DNMT1在膀胱癌组织中过表达，具有统计学意义。 结论： 1.1、膀胱癌组织和正常膀胱粘膜中都存在DNMT1表达，但在膀胱癌组织中存在过表达情况，具有统计学意义； 1.2、DNMT1过表达可能参与了膀胱癌的发生过程，提示DNMT1有可能成为膀胱癌诊断和治疗的分子靶点。 第二部分siRNA沉默膀胱癌细胞DNA甲基转移酶-1(DNMT1)表达 材料与方法： 2.1、细胞来源膀胱癌T24细胞源自上海细胞库。 2.2、实验方法 1、设计并合成三对针对DNMT1的siRNA，于转染T24细胞后24小时后提取细胞总RNA，通过RT-PCR检测筛选出沉默效率最高的siRNA； 2、将筛选出的siRNA与脂质体共转染入膀胱癌T24细胞，分别于24h、48h、72h提取细胞总RNA及总蛋白，分别应用RT-PCR及Western-Blot检测ONMT1转录水平及蛋白水平的变化； 3、将筛选出的siRNA与脂质体共转染到膀胱癌T24细胞株，光镜下直接观察细胞形态变化，MTT法检测细胞存活率及存活指数； 4、利用流式细胞术检测转染前后细胞周期变化和细胞凋亡情况。 2.3、统计学分析 应用SAS8.1统计软件进行分析，用t检验，以α=0.05作为检验水准。 结果： 2.1、转染后膀胱癌T24细胞DNMT1基因转录水平及蛋白水平的变化分别提取不同时间段T24细胞的总RNA作RT-PCR检测。以空白对照组中DNMT1/β-actin的为标准，脂质体组、阴性对照组、siRNA转染后24h、转染后48h和转染后72h组的亮度分别是转染对照组的99.79％、98.35％、66.05％、39.36％和64.86％。 蛋白变化情况：以空白组中DNMT1/β-actin为标准，脂质体组、阴性对照组、siRNA转染后24h、转染后48h和转染后72h组分别是空白对照组98.57％、98.65％、90.21％、71.45％和67.74％。 2.2、MTT法检测细胞存活率与转染前相比，T24细胞株的生长受抑。转染后0h、24h、48h、72h和96h细胞存活率分别为99.08％、60.13％、55.12％、52.22％和40.56％。 2.3、流式细胞术检测结果转染siRNA后细胞周期中S期细胞减少，G2-M期细胞减少，增殖指数PI也有所下降，晚期凋亡细胞数增多。 结论： 应用siRNA干扰能成功的抑制DNMT1基因在膀胱癌细胞株T24的表达，并能有效抑制T24细胞生长，促进细胞凋亡。