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水螅体内除了刺细胞、腺细胞和神经细胞外,其他细胞都具有干细胞特性。其中,间质干细胞可以分化成皮肌细胞以外的所有细胞,外胚层皮肌细胞可以不断分裂形成新的外胚层皮肌细胞,内胚层皮肌细胞亦可以不断分裂形成新的内胚层皮肌细胞,这就是水螅具有强大再生能力的物质基础。但水螅身体不同部位的再生能力并非均衡。水螅极性化体轴的主体为体柱,体柱一端为头区,头区由口、垂唇及触手组成;另一端为足区,足区末端为水螅的固着器官基盘。一般认为分别位于体柱两端的触手和基盘位置的细胞分化程度较高。在水螅体柱任何位置通过切割手术得到的身体片段均能再生成一条水螅体,基盘组织已被证明具备一定程度的再生能力,但触手组织的再生能力目前未知。基于此,本研究开展如下工作: 通过切割手术,获得纯粹的水螅触手组织、1根触手连带垂唇组织、2根触手连带垂唇组织、3根触手连带垂唇组织、4根触手连带垂唇组织及整个头区组织(5或6根触手连带垂唇组织)。再生实验结果表明,纯粹的水螅离体触手组织实验组所有样本全部分解;1根触手连带垂唇组织实验组中的大部分样本完成再生,而小部分样本分解,其余实验组样本全部完成再生。结果显示,纯粹的水螅离体触手组织已失去再生能力,但切割手术时保留在离体触手基部的垂唇组织能促进离体触手的再生。 水螅触手的形态结构及细胞组成与体柱位置类似,但离体的纯粹触手组织为何失去了再生能力?这个现象内在的细胞及分子机理值得深入研究。动物再生主要涉及伤口附近原有旧结构的改造及新生结构的形成。旧结构的改造势必有部分细胞要凋亡,伤口附近的干细胞进行细胞分裂产生新细胞为新生结构提供物质基础。因此,水螅再生进程直接相关的细胞活动主要包括细胞凋亡和细胞分裂。本研究通过实时定量荧光PCR技术对水螅离体触手组织(纯粹触手组织和2根触手连带垂唇组织)在再生进程中细胞凋亡相关基因(Bak和Bcl-2)和细胞分裂相关基因(Pcna)的表达水平的变化进行了测定。纯粹触手组织实验组在8h后的Bak和Bcl-2基因表达量的比值明显低于触手连带垂唇组织实验组,这表明纯粹触手组织实验组细胞凋亡程度较低,这样看手术后离体的水螅纯粹触手组织丧失再生能力的主因并不是其细胞凋亡程度提高。水螅纯粹触手组织实验组在切割手术后Pcna基因表达量波动较小,而触手连带垂唇组织实验组Pcna基因表达量随着再生进程逐渐提高,8h后所有时段表达量均是0h时的2倍以上。 为深入研究水螅纯粹触手组织失去再生能力的细胞和分子机理,本研究还对切割手术后24 h时的水螅纯粹触手组织及2根触手连带垂唇组织进行了比较转录组的测定和分析。纯粹的水螅触手组织与触手连带垂唇组织相比,表达上调的基因共435个,表达下调基因共1007个。所有差异表达基因共涉及79个代谢通路,以富集分析检验P值递增排序的前6个代谢通路分别是嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism)、细胞周期(Cell cycle)、核糖体生物合成(Ribosome biogenesis)、DNA复制(DNA replication)、碱基切除修复(Base excision repair)及嘌呤代谢(Purine metabolism),其中仅核糖体生物合成代谢通路与蛋白质合成有关,其余5个通路均与核酸合成和细胞分裂相关,并且涉及这5个通路的所有差异表达基因在触手连带垂唇组织实验组中为表达上调,而在纯粹触手实验组中为表达下调。在DNA复制和碱基切除修复代谢通路中均为重要节点的增殖细胞核抗原(Pcna)基因在纯粹触手组织与触手连带垂唇组织之间表达量差异显著,触手连带垂唇组织中Pcna基因表达量是纯粹触手组织的120倍左右。纯粹水螅触手组织中Pcna基因表达水平与触手连带垂唇组织相比较显著下调,说明离体的纯粹水螅触手组织内的3种干细胞分裂指数很低或未启动细胞分裂。另外,在差异表达基因所涉及的79个代谢通路中,有15个细胞信号通路,这些信号通路绝大部分与细胞分裂增殖、细胞分化、细胞凋亡、个体发育和伤口愈合等生命活动直接相关。值得注意的是,Ras信号通路(Ras signaling pathway)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Aktsignaling pathway)的主要功能都是抑制细胞凋亡,而这涉及这两个信号通路的差异表达基因都在纯粹触手组织中上调,这个现象暗示纯粹触手组织细胞凋亡程度较低。 综上所述,无论是通过实时定量荧光PCR技术对水螅纯粹触手组织和触手连带垂唇组织之间在再生进程中细胞凋亡相关基因和细胞分裂相关基因表达水平的比较研究,还是水螅纯粹触手组织和触手连带垂唇组织之间的比较转录组的研究均表明离体的纯粹触手组织中细胞凋亡程度和细胞分裂指数都较低,可能是水螅纯粹触手组织缺乏细胞凋亡和细胞分裂诱导因子;而触手连带垂唇组织中细胞凋亡程度和细胞分裂指数均较高,保证了其再生时旧结构的重组以及新生结构的形成,连在触手上的垂唇组织可能带有细胞凋亡和细胞分裂诱导因子。