目的：　　 脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)是临床骨科常见的一种致残性疾病。SCI包括原发性损伤和继发性损伤,脊髓损伤引起的细胞凋亡加重了脊髓的原发性损伤。SCI后细胞凋亡主要发生在损伤的邻近部位,通常发生在损伤8小时内;而神经胶质细胞的凋亡时间更长,损伤第7天时白质内发生的第二波凋亡。凋亡是一个复杂病理生理过程,受多种凋亡相关因子调控。Bcl-2基因家族就是其中之一,主要包括Bcl-2,Bcl-XL,Bcl-xs,Bax,Bad,Bak,Bag,BHRF-1,LMP-1等,其共同特征是在各自的分子上均有BH1和BH2同源结构,但它们的作用却各不相同。Bcl-2是一种具有抗凋亡作用的因子,而Bax为一种具有促凋亡作用的因子,Bcl-2/Bax反映凋亡的趋势。轴突导向因子Eph家族是受体酪氨酸激酶家族最大的成员,目前在哺乳动物已发现16个Eph受体和9个Ephrin配体。目前的研究发现Eph参与中枢神经系统损伤后细胞凋亡调节。Epha3缺失小鼠创伤性脑损伤后细胞凋亡降低,而EphrinB3缺失小鼠细胞凋亡增加;在EphrinB3缺失小鼠侧脑室内灌注大量可溶性的EphrinB3-Fc可逆转细胞增殖和凋亡,并阻止刨伤性脑损伤诱导的细胞增殖。Ephrin-A5诱导脊髓腹侧神经元凋亡,并参与调节脊髓形态发生和轴突导向。EphA7反义寡核苷酸抑制大鼠SCI后神经细胞凋亡,并促进了神经传导功能的恢复。EphrinB1是第一个被克隆的EphrinB族成员,最初被认为是Eph受体连接蛋白和维甲酸敏感基因,胚胎期广泛表达,成年期表达下降。小鼠脑损伤后EphrnB1呈时空依赖性表达上调,参与星形胶质细胞活化和轴突再生。背根切断术增加了背根神经节中EphrinB1表达,并未引起脊髓组织中EphrinB1升高;组织学检测结果显示EphrinB1主要表达于中、小背根神经节的神经元,脊髓背侧浅层神经元和IB4阳性伤害性末端。近年研究发现EphrinB1-Fe促进小鼠胚胎胸腺细胞凋亡和淋巴细胞的凋亡,这种作用与Akt激活和抑制Fas受体引发的半胱天冬酶蛋白水解有关。关于SCI后EphrinB1在胶质细胞的表达情况及其与凋亡相关性的研究目前尚未见报道。　　 本研究拟探讨大鼠SCI后EphrinB1和凋亡相关因子Bcl-2、Bax表达特征,并分析EphrinB1与凋亡相关因子Bcl-2/Bax相关性,初步证实EphrinB1参与SCI后神经细胞凋亡的调节。　　 第一,根据Allen氏原理制作大鼠SCI模型,通过功能学评分和组织病理学检测评估脊髓损伤模型的可靠性。　　 第二,检测大鼠脊髓损伤后不同时间点EphrinB1的表达变化特点。　　 第三,检测大鼠脊髓损伤后不同时间点Bcl-2、Bax的表达变化并分析Bcl-2/Bax值与EphrinB1的表达变化的相关性。　　 方法：　　 1.60只雌性Wistar大鼠随机分为脊髓损伤3、7、14、28d组,假手术组和正常组。根据Allen氏原理制作大鼠脊髓损伤模型。应用Rivlin斜板和Tarlov评分观察SCI后大鼠神经功能情况,通过HE染色观察组织的病理学改变。　　 2.应用免疫组织化学、免疫荧光方法检测大鼠脊髓组织中EphrinB1的表达及分布情况。利用Real-TimePCR技术检测脊髓组织中EphrinB1mRNA的表达变化;WesternBlot检测脊髓损伤后不同时间点EphHnB1蛋白的表达变化,并利用统计软件分析脊髓损伤后EphrinB1mRNA与蛋白表达的相关性。　　 3.应用免疫荧光方法检测大鼠脊髓组织中Bcl-2和Bax的表达情况。利用Real-TimePCR检测各组脊髓组织中Bcl-2和BaxmRNA的表达变化:WesternBlot检测脊髓损伤后不同时间点Bcl-2和Bax蛋白的表达变化;应用统计软件分析Bcl-2和BaxmRNA与蛋白的相关性,并分析EphrinB1与Bcl-2/Bax比值的相关性。　　 结果：　　 1.Rivlin斜板实验结果显示损伤组倾斜平面临界角度值较正常组和假手术组明显下降(P＜0.05)。Tarlov评分正常组和假手术组为6分,损伤3d组小于2分,损伤7d、14d组小于3分,损伤28d组部分评分超过3分;损伤组与正常组和假手术组相比差异显著(P＜0.05)。HE染色结果显示,正常组和假手术组脊髓的形态结构完整;损伤脊髓出现灶性出血、肿胀。神经元和胶质细胞凋亡,结构破坏严重,空泡形成,胶质细胞增生。　　 2.免疫组化结果显示EphrinB1在正常组和假手术组脊髓组织可见少量阳性表达。损伤组可见大量EphrinB1阳性细胞,伤后14d脊髓组织的EphrinB1阳性细胞数较其他损伤组显著增多(P＜0.05)。免疫荧光结果检测发现脊髓组织的星形胶质细胞表达EphrinB1,星形胶质细胞显著增生,EphrinB1和GFAP荧光强度在损伤脊髓显著增强,统计结果显示伤后14d组荧光强度达到高峰。WesternBlot和Real-TimePCR检测发现EphdnB1蛋白和mRNA在正常组和假手术组就有表达;伤后3d开始升高,7d显著升高,14d时达到高峰,28天时降低,但其表达水平较正常组和假手术组有显著性差异(P＜0.05)。统计分析结果显示EphrinB1蛋白与mRNA的表达呈正相关。　　 3.免疫荧光方法检测结果显示Bcl-2和Bax在正常组和假手术组脊髓组织可见少量荧光。损伤脊髓组织中Bcl-2、Bax和GFAP荧光强度显著增强,高峰分别出现在伤后14d和7d。Real-TimePCR和WesternBlot检测发现Bcl-2和Bax蛋白和mRNA在脊髓损伤后升高,Bcl-2的表达高峰为伤后第14d,Bax表达高峰出现在伤后第7d,统计分析结果显示Bcl-2和Bax蛋白与mRNA表达呈显著正相关,EphrinBl表达与Bcl-2/Bax值呈正相关。　　 结论：　　 1.本实验制作的大鼠脊髓损伤模型所需设备简单,操作简便易行,重复性较好,基本满足SCI模型制作标准。　　 2.大鼠脊髓损伤后EphrinBl蛋白表达升高,星形胶质细胞表达EphrinB1EphrinB1的蛋白与mRNA表达变化呈正相关性。　　 3.大鼠脊髓损伤后Bcl-2和Box表达增高,Bcl-2和BaxmRNA与蛋白表达呈正相关,EphrinBl表达与Bcl-2/Bax值呈正相关。