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目的:人类中枢神经系统中80%的恶性原发肿瘤是脑胶质瘤,其预后极差。胶质瘤作为一种血管生成实体瘤,其恶性进展依赖于肿瘤组织中血管的生成。尽管临床上胶质瘤的抗血管生成治疗取得了一些进展,但效果仍不理想。限制抗血管生成疗效的原因之一与胶质瘤细胞的血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)的生成相关。上游开放阅读框(upstream open reading frames,uORFs),常见于真核生物基因的5′UTR,在翻译起始中发挥重要作用。研究发现,人类44%-49%的基因中存在uORFs,一些基因中的uORF会激活无意义密码子介导RNA降解(Nonsense-mediated RNA Decay,NMD),进而促进该基因的降解。锌带蛋白基因反义核糖核酸(zinc ribbon domain-containing 1 antisense RNA 1,ZNRD1-AS1)位于6p22.1号染色体上。有证据表明,ZNRD1-AS1在肺癌组织中高表达,并且ZNRD1-AS1和其功能性Cis-eQTL促进肺癌的发生。研究发现ZNRD1-AS1的5′UTR存在编码144个氨基酸序列长度的uORF(ZNRD1-AS1-144aa-uORF,以下简称144aa-uORF)。目前尚未见144aa-uORF及ZNRD1-AS1在胶质瘤中表达并参与功能调控的研究报道。MicroRNAs(miRNAs)由18-25个核苷酸组成,是一类短链非编码RNA分子。miR-449a-5p位于5q11.2染色体上,最新研究表明,miR-499a-5p在脑胶质瘤中发挥抑癌作用,抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭,而促进细胞的凋亡。ELF1(E74 like ETS transcription factor 1),属于ETS家族,位于13q13.3-13q14.11区域。ELF1在子宫内膜癌和卵巢癌中高表达。EMI1(early mitotic inhibitor-1)也称为FBXO5(F-box only protein 5),是一种重要的细胞周期调节因子。EMI1在肝细胞癌、乳腺癌、卵巢透明细胞癌组织中高表达。目前,尚无ELF1和EMI1在胶质瘤中的表达与功能的相关研究报道。本研究旨在研究ZNRD1-AS1-144aa-uORF通过ZNRD1-AS1/miR-499a-5p/ELF1/EMI1途径调控胶质瘤细胞血管生成拟态等生物学行为的分子机制。为胶质瘤的发生发展提供新的依据,同时也为胶质瘤的分子靶向治疗提供新靶标。研究方法:以人正常星型胶质细胞、人胶质瘤细胞U87、U251和人胚肾细胞HEK293T作为研究对象。应用Real-time PCR方法检测ZNRD1-AS1、miR-499a-5p、ELF1和EMI1,应用Western blot方法检测144aa-uORF、ELF1和EMI1在正常脑组织、胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞、胶质瘤细胞中的表达水平。应用CCK-8、Transwell、管形成实验分别检测细胞的增殖、迁移侵袭、管形成能力的改变。通过细胞转染方法构建并筛选144aa-uORF过表达的细胞系,ZNRD1-AS1、EMI1沉默的细胞系,以及ELF1、miR-499a-5p过表达和表达沉默的细胞系,研究其在胶质瘤细胞的血管生成拟态等恶性生物学行为中的作用。Real-time PCR方法检测ZNRD1-AS1、ELF1的mRNA和miR-499a-5p的表达变化。Western Blot方法检测144aa-uORF、ELF1、EMI1蛋白的表达变化。RIP和RNA pull down实验验证ZNRD1-AS1和UPF1存在结合作用。放线菌素D法检测ZNRD1-AS1半衰期的改变。双荧光素酶基因报告系统检测ZNRD1-AS1与miR-499a-5p、miR-499a-5p与ELF1的靶向结合作用。ChIP实验分析ELF1与EMI1启动子区的直接结合作用。裸鼠移植瘤实验检测144aa-uORF,ZNRD1-AS1及ELF1对裸鼠皮下移植瘤的生长和原位移植瘤裸鼠生存时间的影响。结果:本研究发现144aa-uORF在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达144aa-uORF能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。ZNRD1-AS1在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默ZNRD1-AS1能够抑制U87和U251细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。144aa-uORF通过降低ZNRD1-AS1的稳定性,降低其表达发挥抑癌基因的作用。miR-499a-5p在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达miR-499a-5p能显著抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。ZNRD1-AS1 3’UTR与miR-499a-5p存在靶向结合作用。ELF1在胶质瘤组织及细胞中高表达,沉默ELF1能够显著抑制U87和U251细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。miR-499a-5p能够分别与ZNRD1-AS1及ELF1 mRNA的3’UTR区结合。沉默ZNRD1-AS1通过负性调控miR499a-5p,降低ELF1的表达,抑制胶质瘤细胞血管生成拟态形成。EMI1在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默EMI1显著抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成拟态形成。ELF1能够与EMI1的启动子区结合,增加其启动子活性,促进胶质瘤细胞血管生成拟态形成。ZNRD1-AS1(-)、144aa-uORF(+)及EMI1(-)的单独以及联合应用,抑制裸鼠肿瘤生长,并延长裸鼠的生存时间。结论:1.ZNRD1-AS1-144aa-uORF、miR-499a-5p在脑胶质瘤组织及细胞中低表达,ZNRD1-AS1、ELF1、EMI1高表达。沉默ZNRD1-AS1、ELF1、EMI1的表达以及过表达144aa-uORF、miR-499a-5p能够抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。2.144aa-uORF通过NMD途径,降低ZNRD1-AS1的稳定性。ZNRD1-AS1靶向结合miR-499a-5p。过表达144aa-uORF,通过降低ZNRD1-AS1的稳定性,减弱其与miR-499a-5p的结合作用,抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。3.miR-499a-5p与ELF1 mRNA 3’UTR靶向结合。ZNRD1-AS1通过结合miR-499a-5p,抑制miR-499a-5p对ELF1的负性调控作用,促进胶质瘤血管生成拟态形成。ELF1与EMI1的启动子直接结合,并增强其活性。过表达miR-499a-5p通过降低ELF1的表达,抑制EMI1的转录,抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。4.ZNRD1-AS1-144aa-uORF通过ZNRD1-AS1/miR-499a-5p/ELF1/EMI1通路在调控胶质瘤血管生成拟态中发挥重要作用。