论文部分内容阅读
背景：不断提高骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗心肌梗死(MI)效率是亟待解决的问题。近期多项实验研究发现超声联合微泡干预有增效干细胞移植治疗MI的作用，具有良好的应用前景。本课题组前期研究发现超声联合一氧化氮(NO)微泡体外干预MSCs对其增殖、凋亡以及细胞周期无显著影响。超声联合NO微泡介导MSCs移植治疗MI的体内效应及机制的研究尚属空白。 目的：1.探讨超声联合NO微泡促进经静脉移植MSCs归巢大鼠缺血心肌的可行性及可能机制；2.探讨超声联合NO微泡干预MSCs移植改善梗死后心功能的有效性及可能机制。 方法：1、大鼠骨髓MSCs的分离培养、鉴定及标记：密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓MSCs；形态学观察及流式细胞仪检测CD44、CD29、CD34及CD45进行MSCs鉴定；CM-Di1体外标记MSCs，荧光显微镜观察标记效率。2、大鼠MI模型的制备与评价：冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型，以心电图、血清学、影像学及病理学等指标评价模型制备成功与否。3、超声联合NO微泡干预MSCs移植治疗心肌梗死的效应及机制：①40只大鼠成功制备MI模型一周后随机分为PBS组、MSCs组、超声联合微泡组及超声联合NO微泡组(n=10)。PBS组直接从尾静脉注射2mLPBS，其余不作干预；MSCs组直接将CM-Di1标记的MSCs约1×107细胞量用2mLPBS稀释后经静脉缓慢注射，其余不作干预；超声+微泡+MSCs组首先经尾静脉注入普通声诺维微泡0.1mL/kg，注入微泡同时启动超声，1MHz、2W/cm2，作用10分钟，作用结束后将CM-Di1标记的MSCs约1×107细胞量用2mLPBS稀释后静脉缓慢注射；超声+NO微泡+MSCs组移植方法及条件同超声+微泡+MSCs组，仅将普通微泡换作NO微泡，用量同普通微泡。②干预后48h随机处死每组各3只大鼠，取梗死区心肌组织作冰冻切片，计数比较各组缺血心肌内荧光标记阳性MSCs。③4周后对每组剩余大鼠行M型心脏超声观察比较各组左心室收缩功能。④心功能检测结束后处死所有大鼠，取梗死区心肌组织行石蜡切片及HE染色，计数比较各组心肌缺血区的毛细血管密度，同时应用Western-blotting及RealTime PCR检测比较局部心肌SDF-1、VEGF的表达水平。 结果：1、密度梯度离心法分离培养的MSCs贴壁生长，以梭形为主，形态较均一。流式细胞检测结果显示细胞表面高表达CD44(99.34％)及CD29(99.35％)，几乎不表达CD34(1.47％)及CD45(1.56％)。荧光显微镜观察显示绝大部分细胞均可被CM-Di1标记，细胞膜呈均匀明亮的红色，CM-Di1标记的阳性率约为96.72％。2、冠状动脉左前降支结扎法建立MI模型后，心电图呈现ST段偏移、病理性Q波等动态变化，TnI、CK-MB明显升高，Masson染色左室前壁梗死区呈蓝染，左室收缩功能明显降低。3、荧光显微镜观察计数各组心肌缺血区CM-Di1阳性MSCs显示：超声+NO微泡+MSCs组荧光阳性细胞数为59.22±17.63个，较超声+微泡+MSCs组(45.33±14.97)及MSCs组(31.88±5.71)增多，差异有统计学意义(P<0.05)。4、心功能检测结果显示：超声+NO微泡+MSCs组EF值为56.27±3.66％，较超声+微泡+MSCs组(51.31±3.22％)、MSCs组(45.81±3.37％)及PBS组(43.66±4.79％)显著改善，差异有统计学意义(P<0.05)。5、平均毛细血管密度计数结果显示：超声+N0微泡+MSCs组平均毛细血管密度为45.96±9.10个，较超声+微泡+MSCs组(28.07±4.93)、MSCs组(21.41±5.27)及PBS组(18.04±4.82)增多，差异有统计学意义(P<0.05)。6、Western-blotting及Real Time PCR检测结果显示：超声+NO微泡+MSCs组SDF-1、VEGF的表达水平较其他各组升高。 结论：1.密度梯度离心法可成功实现大鼠BMSCs的分离培养。2.冠状动脉左前降支结扎法可建立稳定的大鼠MI模型。3.CM-Di1可以在体外有效标记MSCs，标记方法简单、操作简便，并且可以有效示踪MSCs在体内的分布。4.超声联合NO微泡可促进静脉移植的MSCs向心肌缺血区归巢，可能与超声联合NO微泡促进局部SDF-1的表达有关。5.超声联合NO微泡可以改善MI后心功能，可能与促进局部VEGF表达、刺激血管生成有关。