目的:Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophin,DMD)是一种X连锁隐性遗传致死性肌肉病,在存活男婴中的发病率约为1/3500。以进行性加重的对称性肌肉无力和萎缩为主要临床特征,患者一般6-12岁丧失行走能力,20岁左右死于心肺衰竭。DMD患者发病是由DMD基因突变导致dystrophin蛋白缺失引起。Dystrophin蛋白,一方面,作为细胞膜骨架维持肌细胞的完整性与稳定性,对抗机械收缩对细胞造成的损伤;另一方面dystrophin蛋白有信号转导的作用包括机械力的传导,以及聚集一些信号转导蛋白参与细胞内信号转导。Dystrophin蛋白缺失导致肌纤维对机械和化学损伤更加敏感,同时引起肌细胞内信号通路紊乱,进而通过各种机制,如细胞内钙超载、氧化应激、炎症反应、自噬凋亡等导致肌组织中大量炎细胞浸润、肌纤维坏死,最终由脂肪和纤维结缔组织代替。DMD的致病基因二十多年前就已经被确定,但直到现在仍无有效的治疗办法。虽然基因治疗为DMD患者提供了希望,但真正用于DMD的临床治疗并且达到治愈的目的还有很多难以克服的障碍。经过多年的研究探索,我们对DMD的病理生理机制已经有了很好的理解。因此,我们可以通过干预促进肌营养不良发生发展的细胞和分子机制,减慢DMD患者疾病进展、改善临床症状。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是生理性和病理性血管生成的主要调节因子,涉及调节血管生成,促肌细胞再生,改善灌注等多种生物学作用。已有研究证实,在肌肉损伤性疾病模型中,VEGF可以减少肌肉损伤,促进肌再生。近年来,以血管为靶点的治疗,如血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI),用于改善DMD患者心脏功能及系统性血管舒张能力,临床试验已证明了其有效性。所以VEGF是否能减缓DMD患者的疾病进展,改善临床症状,值得我们进一步探索。mdx小鼠是DMD研究的经典动物模型,由C57BL/10小鼠DMD基因自发点突变形成。本实验以AAV9为载体携带VEGF基因,经尾静脉注射入mdx小鼠体内,使mdx小鼠体内VEGF过表达,从而进一步探讨vegf能否改善mdx小鼠的肌肉组织病理及肌肉功能。方法:我们的前期实验观察到mdx小鼠在8w时肌肉病理改变最为严重,在本实验中我们首先进一步对8wmdx小鼠的肌肉损伤进行了评估,为后续实验提供数据参考及客观可行的评估方案。1观察8周龄mdx小鼠的血清学、病理学和肌力改变。选取8w雄性c57bl/10scsn-dmdmdx/jnju鼠(以下简称mdx小鼠)为实验鼠(mdx组),8w雄性野生型小鼠(c57bl/10scsn小鼠)为对照鼠(wt组)。每组选取10只,5只用于前肢握力检测及留取血清标本;5只用于后肢肌力检测及常规组织化学染色。选取5只小鼠,测量前肢抓力,然后以10%水合氯醛(350mg/kg体重)腹腔注射麻醉,摘除小鼠眼球取血,留取血清标本,用于血清ck值测定;另外选取5只小鼠,以10%水合氯醛(350mg/kg体重)腹腔注射麻醉,分离胫骨前肌,对其收缩功能进行原位分析,分析完成后,移除胫骨前肌称重。取小鼠胫骨前肌进行包埋冰冻处理或直接冰冻处理。通过冰冻切片的常规染色(he染色)观察肌组织病理改变,并对肌纤维再生及坏死情况进行评估。2观察aav9介导的vegf基因过表达对mdx小鼠的影响。2.1验证在本实验室条件下aav9所携带基因能在小鼠体内进行表达。选取3对6w同窝雄性野生型小鼠,3只未给予任何处理,作为空白对照;3只给予aav9-gfp(150ul/只1x1012vg/ml)尾静脉注射,单次注射后3周,在激光共聚焦显微镜下观察肌肉组织中绿色荧光蛋白gfp(greenfluorescentprotein,gfp)的表达情况。2.2选取6w雄性野生型小鼠为正常对照组(wt组);选取6w雄性mdx小鼠,分为两组:mdx组(不给与任何处理),aav9-vegf组(给予aav9-vegf150ul/只,尾静脉注射),每组5只小鼠。单次给药后观察4w,在小鼠10w时对其进行肌损伤程度的定量评估。评估方法同上。应用spss13.0系统对数据进行分析。结果:18wmdx小鼠的血清学、病理学和肌力改变。1.1血清ck水平:mdx小鼠血清ck水平较wt组明显升高。1.2肌肉病理:he染色中,mdx小鼠胫骨前肌、腓肠肌及膈肌中心核肌纤维比例与wt组相比明显升高。mdx小鼠胫骨前肌、膈肌肌纤维最小feret直径变异度明显大于wt组。mdx小鼠胫骨前肌、腓肠肌及膈肌炎症坏死区域占总面积的百分比明显高于wt组。1.3肌力:小鼠抓力测试中,mdx小鼠5次重复测量的肌力均小于wt组;第5次测量的肌力和第1次测量的肌力相比,其下降的百分率约为56%,明显高于wt组。胫骨前肌收缩功能的原位分析:在不同频率下mdx小鼠所测定的最大强直收缩力均小于wt组;连续9次离心收缩后所测得的最大等长收缩力和初始的最大等长收缩力相比,其下降的百分率约为80%,明显高于wt组。2aav9介导vegf基因过表达改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能。2.1wt组小鼠经尾静脉注射aav9-gfp后,观察到其肌肉组织中有绿色荧光蛋白的表达。验证了在本实验室条件下aav9可以成功的转染肌细胞并表达所携带的基因。2.2westrenblotting结果表明与wt组、mdx组相比,aav9-vegf组小鼠肌肉组织中vegf含量升高。2.3aav9-vegf组、mdx组、wt组肌肉损伤程度定量比较。2.3.1血清ck水平:aav9-vegf组血清ck水平(46249.5u/l)较mdx组降低(73418u/l),较wt组升高(2746.5u/l),差异有统计学意义。2.3.2肌肉病理:he染色中,aav9-vegf组小鼠炎症坏死区域占总面积的百分比为0.992±0.22%,低于mdx组,高于wt组,差异均有统计学意义;aav9-vegf组再生肌纤维数目占总纤维数的百分比27.97±3.3%,高于mdx组,差异无统计学意义;高于wt组,差异有统计学意义。2.3.3肌力:aav9-vegf组小鼠5次重复测量的肌力均小于wt组,大于mdx组,差异均有统计学意义;第5次测量的肌力和第1次测量的肌力相比,aav9-vegf组下降的百分率约为57%,高于wt组,低于mdx组,差异均有统计学意义。结论:vegf能在一定程度上改善mdx小鼠的肌组织损伤,为dmd提供了新的治疗方向,如何使vegf发挥最佳作用还需我们进一步探索。