论文部分内容阅读
蛋白质的折叠一直是生物学研究热点之一,分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠、跨膜转运、降解等途径中起很重要的作用.黑曲霉有很强的蛋白质分泌功能和与高等真核生物类似的翻译后加工特性,是表达哺乳动物基因的理想体系之一.因此研究黑曲霉的折叠因子无论在理论上还是实用上都有重要的意义.该文对Aspergillus niger的PDI相关蛋白质A(PDI-related protein A,PRPA)和结合蛋白A(binding protein A,BiPA)进行了研究.一.PRPA的功能的研究1.经过RT-PCR从Aspergillus Niger中获得了PRPA的基因,并在BL21(DE3)中进行了表达.通过超声破碎、硫酸铵沉淀和Bio-Rex70柱层析获得了电泳均一的PRPA(纯度在90﹪以上).PRPA有比较弱的二硫键异构酶活性.2.在Hepes溶液中,PRPA不仅降低变性还原的溶菌酶复性率而且还降低它的复性速率.亚化学计量的PRPA促进变性还原的溶菌酶聚集(抗分子伴侣活性),在化学计量的PRPA则增加溶菌酶的可溶性(类似分子伴侣活性).而在PBS溶液中,PRPA只呈现类似分子伴侣活性,即促进变性还原的溶菌酶形成可溶性形式.3.无论在Hepes溶液还是在PBS溶液中,PRPA单独不形成沉淀,但却与变性还原的溶菌酶形成共沉淀.在HEPES复性体系,无论在氧化还原(GSSG/GSH)或还原条件下,PRPA对溶菌酶可溶性的影响不变.PRPA的ANS结合荧光光谱表明PRPA表面有疏水区域.在复性体系中外加乙二醇或尿素能减缓PRPA对变性还原的溶菌酶复性的抑制.不同尿素浓度下的PRPA的ANS结合荧光光谱表明尿素能降低PRPA表面的疏水性.由此可见PRPA是通过疏水相互作用而不是二硫键交联来影响溶菌酶的复性.4.分别将PRPA与凝乳酶原或纤溶酶原激活剂的突变体在E.coli中共表达,发现PRPA可以增加二者的可溶性却没有增加它们的生物学活性.PRPA的结构和生物学特性说明它在对蛋白质折叠、维持蛋白质的可溶性状态等方面起重要的作用.二BiPA的基因克隆、表达与纯化的研究通过RT-PCR等基因工程方法从Aspergillus Niger中获得了有信号肽和去掉信号肽的BiPA的cDNA.构建了含信号肽的BiPA表达质粒,并在E.coli中进行了表达.通过超声破细胞、硫酸氨分级沉淀、DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析和ATP-agarose亲和层析得到了电泳均一的BiPA(纯度为90﹪).将BiPA分别与凝乳酶原或与纤溶酶原激活剂的突变体进行共表达时发现,BiPA没有增加二者的可溶性.BiPA的生物学功能还有待于进一步研究.