家蚕表皮型几丁质合成酶基因克隆、表达及其调控机理的研究

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几丁质是昆虫表皮的主要组成成分,昆虫表皮几丁质合成酶是催化几丁质合成的主要酶,因而在昆虫生长发育中起着重要的作用,其功能已有较为详细的研究,但其表达调控机理至今仍没见有报道。本研究以害虫为主的鳞翅目模式昆虫家蚕为研究对象,开展表皮几丁质合成酶基因克隆、表达和调控机理的研究,以期了解昆虫表皮合成的调控途径,为发展有效害虫防治新方法提供理论基础。研究结果如下:  (1)在NCBI和家蚕基因组数据库中现有的BmCHSA部分基因序列基础上,克隆获得了BmCHSA的1号外显子(141 bp)和2号外显子(2a,106 bp)。证实了BmCHSA在2号外显子存在选择性剪切(2b),完善了家蚕该基因的序列。将家蚕的exon2a/2b在鳞翅目斜纹夜蛾基因组中进行balst分析,发现斜纹夜蛾存在同样的选择性剪切,表明在2号外显子存在的选择性剪切可能是鳞翅目昆虫普遍存在的。  (2)Real-Time PCR分析发现BmCHSA-2a/2b主要在表皮表达,且以BmCHSA-2a的表达为主;BmCHSA-2a主要在幼虫-幼虫蜕皮,幼虫-蛹转化以及蛹后期高表达;对比家蚕体内20E的滴度变化,发现BmCHSA-2a高表达总是在20E峰消退之后,即其表达滞后于20E峰。BmCHSA-2b则在翅原基的蛹期高表达。  (3)激素注射实验表明,BmCHSA-2a在20E处理早期被抑制,在20E滴度下降至本底时(pulse)上调达到高峰。表皮组织的体外离体培养实验也很好的证明了这一结论,当20E从培养基去除后,BmCHSA-2a开始上调。而注射JH模拟物methoprene,BmCHSA-2a的表达变化并不明显。  (4)克隆了BmCHSA-2a启动子,分析发现了受20E pulse调控的转录因子BmβFTZ-F1。激素注射实验和表皮组织离体培养实验的研究结果表明,其表达模式与BmCHSA-2a的极为相似。也呈现出先抑制后上升的现象,并且发生抑制和上调的时间要早于BmCHSA-2a基因。  (5)EMSA结合实验表明:BmCHSA-2a启动子上的BmβFTZ-F1调控元件与表皮核蛋白存在竞争性结合,结合在竞争探针浓度从10×到200×时逐渐消失;结合在蜕皮期增强;在20E处理48 h后结合也明显增强,这与BmCHSA-2a在体内的表达情况相一致。果蝇βFTZ-F1抗体实验证明与BmβFTZ-F1调控元件结合的蛋白中可能存在BmβFTZ-F1蛋白。实验初步表明BmCHSA-2a可能通过20E pulse效应经BmβFTZ-F1启动表达。
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