黑林1号杨转几丁质酶基因的研究

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黑林1号(Populus simonii×Populus nigra)×Populus 15 ACL是以小黑杨为母本,波兰15A为父本,人工杂交选育的优良无性系,其根系发达,生长迅速,抗旱、耐寒。7年生材积生长量平均比小黑杨大42%。该品系可用于营造农田、防护林、用材林。本论文以MS+0.3mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA为分化培养基、WPM+0.4mg/L IBA为生根培养基,以外源几丁质酶基因为目的基因,在此基础上进行黑林1号的组培体系建立及遗传转化研究,通过叶片及组培苗茎段的敏感性试验,最终确定叶片分化时卡那霉素的临界浓度为20mg/L,芽诱导生根时卡那霉素的临界浓度为10mg/L,抑菌抗生素头孢塞肟钠500mg/L的浓度不会对黑林1号叶片分化及生根培养产生不利影响。成功摸索出农杆菌介导的黑林杨遗传转化体系:选取生长20d左右的幼嫩黑林杨组培苗叶片,通过主叶脉剪2~3下,预培养2~3d;将培养至对数生长期的农杆菌(OD600=0.5~0.7)离心后用液体MS培养基或无菌蒸馏水稀释成OD600=0.3~0.4浓度进行浸染;侵染时间为6~10min;共培养2~3d后,转入到筛选培养基中进行诱导不定芽的产生(含有20mg/L卡那霉素和500mg/L的头孢塞肟钠),以及生根阶段的卡那霉素连续筛选(含有10mg/L卡那霉素和500mg/L的头孢塞肟钠)。通过农杆菌介导法将外源几丁质酶基因导入到黑林1号杨基因组中,为黑林1号的遗传转化及抗性育种提供了理论基础。PCR分子检测经过两次继代后成活的转化苗,有8株出现特异性扩增条带,而阴性对照没有特异性条带出现;通过PCR-Southern进一步分子杂交检测,出现了特异性的杂交条带,阳性率为100%,说明外源基因已经整合到黑林1号基因组中。黑林1号的遗传转化中最高转化率达到4.12%。
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