自上个世纪 60 年代以来，关于纳米乳的研究得到了飞速的发展。到目前为止，纳米乳化技术已渗透到材料、化工、环境以及生物科学等领域，成为当今具有巨大应用潜力的研究领域之一。制备纳米乳的传统乳化方法大致可分为机械法和物理化学法两大类，即高能乳化法和低能乳化法，但伴随有较高浓度表面活性剂和剧烈机械剪切力的引入，不利于生物活性物质在体内的递送与应用。因此，近年来纳米乳药物递送系统亟需克服现有的潜在毒性或不稳定性等诸多限制性瓶颈难题。为了构建更加安全高效的纳米乳递药系统，本课题提出通过亲水共聚物与油相分子基于非共价键相互作用实现界面自组装构建纳米乳液，成功避免表面活性剂的引入，制备条件简便温和，纳米乳稳定性较好，同时负载难溶性药物后显著提高口服生物利用度，成功实现急性炎症靶向的成像和治疗效果。　　方法：　　1.阳离子亲水嵌段共聚物的合成　　将 L-天冬氨酸苄酯经三光气催化得到中间产物 β-苄基-L-天冬氨酸 N-羧酸酐（BLA-NCA），随后与分子量为 5000的端氨基聚乙二醇（PEG，无特殊标注时 PEG均代指分子量为5000的聚乙二醇）或分子量为2000的端氨基聚乙二醇（PEG2k）通过聚合反应得到聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯共聚物（PEG-PBLA）。分别利用乙二胺（EDA）、二乙烯三胺（DETA）及三乙烯四胺（TETA）进行氨解后得到最终的阳离子亲水嵌段共聚物，分别为含乙二胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PEDA）、含二乙烯三胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PDETA）以及含三乙烯四胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PTETA）。　　2.含β-环糊精的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物的合成　　将合成得到的 PEG-PBLA 经炔丙胺（PPA）氨解后得到含炔丙胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PPPA），随后通过点击化学在一价铜离子的催化下合成得到含β-环糊精的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PCD），产物经透析法纯化。　　3.亲水嵌段共聚物的结构表征　　取适量阳离子亲水嵌段共聚物及 PEG-PCD 分别通过核磁、红外光谱及质谱进行聚合物结构表征，并计算聚天冬酰胺段的取代数量。　　4.亲水嵌段共聚物的初步生物安全性评价　　取大鼠红细胞进行体外溶血实验，通过拍照观察溶血现象，并测定波长为 570 nm与620 nm处的吸光度值，计算不同亲水嵌段共聚物的溶血百分数。　　昆明小鼠称重后，尾静脉注射给予500 mgkg-1亲水嵌段共聚物材料。注射后，记录体重并观察其基本生命体征。14 天后，处死小鼠取血样测定血常规，并取血清测定肝肾功指标。同时取小鼠主要脏器，计算脏器指数并进行组织病理学分析。　　5.静电作用纳米乳的制备及理化性能表征　　将不同的阳离子亲水嵌段共聚物溶于去离子水中，加入不同体积的脂肪酸后涡旋30 s，得到静电作用纳米乳。利用动态光散射法测定其液滴粒径，利用激光粒度仪测定其表面电位，油相经尼罗红标记后采用超高分辨率显微镜及激光共聚焦进行荧光观察，经戊二醛交联后利用透射电子显微镜观察纳米乳形态。　　6.包合作用纳米乳的制备及理化性能表征　　将PEG-PCD溶于去离子水中，加入不同体积的苄醇（BA）后涡旋30 s，得到包合作用纳米乳。利用动态光散射法测定其液滴粒径，利用激光粒度仪测定其表面电位，油相经尼罗红标记后采用超高分辨率显微镜及激光共聚焦进行荧光观察，经戊二醛交联后利用透射电子显微镜观察纳米乳形态。　　7.氢键作用纳米乳的制备及理化性能表征　　将聚乙二醇聚（N-异丙基丙烯酰胺）共聚物（PEG-PNIPAm）溶于去离子水中，加入不同体积的脂肪酸后涡旋30 s，得到氢键作用纳米乳。利用动态光散射法测定其液滴粒径，利用激光粒度仪测定其表面电位，油相经尼罗红标记后采用激光共聚焦进行荧光观察，经戊二醛交联后利用透射电子显微镜观察纳米乳形态。　　8.亲水性共聚物与油相分子间的相互作用的测定　　利用等温滴定量热法（ITC）测定亲水性共聚物与油相分子间的相互作用，同时得到亲和力及相关热力学参数，包括焓变、熵变及吉布斯自由能变。　　9.不同乳液体系的芘荧光光谱测量　　利用芘荧光探针法测定聚合物水溶液及乳液疏水性的变化。称取适量的聚合物材料配制不同浓度的水溶液及含不同体积油相的乳液样品，样品中芘的终浓度为6.0 × 10?7M。利用荧光光谱仪扫描芘的激发光谱与发射光谱，固定发射波长为390 nm扫描300 nm～360 nm激发光谱；随后固定激发波长为339 nm，扫描360 nm～460 nm发射光谱。　　10.界面张力的测量　　采用最大气泡法测定乳液中油水界面张力。根据杨-拉普拉斯公式，最大气泡时压力值将反应此体系中油水界面张力。考察聚合物浓度、油相体积分数等因素对油水界面张力的影响。　　11.纳米乳的初步体内安全性评价　　昆明小鼠称重后，口服灌胃给予 33 ml kg-1纳米乳。每天记录体重，观察其基本生命体征。 14 天后，处死小鼠取血样测定血常规，取血清测定肝肾功指标。 取小鼠主要脏器并称重，计算脏器指数，同时进行组织病理学分析。　　12.基于纳米乳模板制备不同结构的功能材料　　称取不同的聚合物溶于二氯甲烷，加入已制备好的纳米乳中，超声20 s后室温搅拌挥发溶剂得到不同结构的功能材料，采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察其微观结构。　　13.载药纳米乳的制备及表征　　称取一定量的难溶性小分子药物溶于苄醇，浓度为50 mgml-1，然后分别与1 ml浓度为10mg ml-1的PEG-PCD水溶液按照O:W=0.06:1涡旋30 s得到载药纳米乳。拍照观察外观，激光粒度仪测定粒径分布。　　14.体内药动学实验　　SD 大鼠经口服灌胃给予载药纳米乳后按时间点采集血浆，利用高效液相色谱法测定血药浓度，并采用DAS 3.0软件计算得到药动学参数。　　15.吲哚美辛（IND）载药纳米乳的体内抗炎疗效评价　　通过角叉菜胶诱导的急性足趾肿胀模型来评价吲哚美辛载药纳米乳在抗炎药物靶向治疗中应用，利用足趾容积测量仪测定各时间点足趾部位的肿胀度，评价急性炎症程度。　　16.紫杉醇（PTX）载药纳米乳的体内抗肿瘤活性评价　　A549细胞经裸鼠右后背部皮下接种，待肿瘤体积大小约 150 mm3时，静脉注射给予不同的紫杉醇制剂，评价其体内抗肿瘤活性；小鼠处死后取其心、肝、脾、肺、肾，计算其脏器指数，测定肝肾功指标和血脂水平的变化。　　17.纳米乳的炎症成像能力评价　　通过角叉菜胶诱导的急性足趾肿胀模型和脂多糖溶液滴鼻诱导的急性肺损伤模型来评价负载荧光染料Cy7.5的纳米乳在体内成像的效果。模型成功后尾静脉注射荧光纳米乳，随后利用活体动物成像系统进行小鼠在体成像或脏器离体成像。　　结果：　　1.基于聚乙二醇和天冬氨酸苄酯成功合成了一系列阳离子亲水嵌段共聚物（PEG-PEDA、PEG-PEDTA 及 PEG-PTETA）和含 β-环糊精的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PCD），通过核磁、红外确定了其结构，PEG-PEDA、PEG-PEDTA 及 PEG-PTETA中聚天冬酰胺段的取代度分别为 22、19及 16，PEG-PCD中聚天冬酰胺段的取代度为16。上述聚合物在体外无溶血反应，500 mgkg-1静脉注射剂量下对小鼠并未表现出明显的毒副作用或造成明显的病理变化。　　2.在亲水聚合物与油相共存的情况下，油水界面张力显著降低，溶液体系中芘荧光强度发生变化。同时，油相分子中相互作用段氢原子的核磁谱峰发生位移。　　3.随着油相体积分数的增加，体系中依次呈现胶束、囊泡以及纳米乳的结构形态。温度、聚合物浓度及结构的改变影响最终制备得到的纳米乳粒径及形态。　　4.利用适当浓度的亲水性共聚物水溶液与超过临界油相体积分数的油相分子成功构建非共价键作用纳米乳，包括静电作用、主客体包合作用及氢键作用，液滴粒径均小于200 nm。　　5.在纳米乳的基础上继续增加油相体积分数成功实现乳液的相反转，得到稳定的双连续相及反相乳液。　　6.基于静电作用纳米乳成功制备了 PLGA纳米粒，并增溶金属纳米晶体得到纳米金（银）的水分散溶液。基于包合作用纳米乳成功制备了聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒、聚己内酯（PCL）纳米粒及 PCL微球，并且得到了 PLGA、聚乳酸（PLA）、聚N-苯基丙烯酰胺（PNPAm）等材料的多孔聚合物结构。　　7.包合作用纳米乳能够增溶 IND、PTX等多种疏水性小分子药物形成载药纳米乳，体内药动学评价证明包合作用纳米乳能够明显增加 IND和 PTX的生物利用度，其药时曲线下面积为IND和PTX原料药的2倍和3倍。　　8.包合作用纳米乳负载荧光染料 Cy7.5 后在小鼠足趾肿胀模型中具有良好的成像功能。同时在小鼠急性肺损伤模型中通过离体脏器成像显示 Cy7.5荧光主要富集在肺组织。　　9.自组装纳米乳在 33 ml kg-1口服剂量下对小鼠并未造成明显的病理变化及表现出明显的毒副作用，具有较好的生物安全性。　　结论：　　1.成功构建了基于亲水性共聚物界面自组装纳米乳液体系，制备方法简便，条件温和，灵活性较好，可制备多种类型的稳定乳液，包括水包油型（O/W）、油包水型（W/O）单乳及水包油包水型（W/O/W）、油包水包油型（O/W/O）双重乳液。　　2.成功揭示了该自组装纳米乳的形成机制，即亲水性共聚物与相应油相分子基于非共价键作用后显著降低界面张力。同时发现了该纳米乳形成过程中经过了较短的胶束及囊泡过渡阶段。　　3.基于自组装纳米乳模板成功制备多种不同结构的功能材料，包括纳米粒、微球以及多孔有序的聚合物结构。　　4.包合作用纳米乳具有增溶疏水性小分子药物的能力，负载药物后显著提高其口服生物利用度，相比原料药具有更好的抗炎效果和抗肿瘤效果，同时降低药物副作用。另外，在负载荧光染料后对体内急性炎症病灶部位成像能力较好。　　5.基于非共价键作用力构建的自组装纳米乳具有较好的体内生物安全性。　　综上所述，本课题克服了传统乳化法的缺点，构建了一种新颖的基于亲水性共聚物界面自组装纳米乳液作为更加安全高效的体内药物递送系统。首次利用静电作用、氢键作用及主客体包合作用制备不含任何表面活性剂或胶体粒子的纳米乳液，制备方法简便，条件温和，乳液稳定性及生物安全性较好。以此为模板可制备多种聚合物纳米结构，同时可增溶疏水性药物后显著提高生物利用度，实现体内急性炎症的治疗及成像。该载药系统制备工艺简单，适用性强，应用范围广，在纳米材料与纳米医学领域均有着良好的发展潜力，为现代临床诊疗一体化提供有效的策略。　　自上个世纪 60 年代以来，关于纳米乳的研究得到了飞速的发展。到目前为止，纳米乳化技术已渗透到材料、化工、环境以及生物科学等领域，成为当今具有巨大应用潜力的研究领域之一。制备纳米乳的传统乳化方法大致可分为机械法和物理化学法两大类，即高能乳化法和低能乳化法，但伴随有较高浓度表面活性剂和剧烈机械剪切力的引入，不利于生物活性物质在体内的递送与应用。因此，近年来纳米乳药物递送系统亟需克服现有的潜在毒性或不稳定性等诸多限制性瓶颈难题。为了构建更加安全高效的纳米乳递药系统，本课题提出通过亲水共聚物与油相分子基于非共价键相互作用实现界面自组装构建纳米乳液，成功避免表面活性剂的引入，制备条件简便温和，纳米乳稳定性较好，同时负载难溶性药物后显著提高口服生物利用度，成功实现急性炎症靶向的成像和治疗效果。　　方法：　　1.阳离子亲水嵌段共聚物的合成　　将 L-天冬氨酸苄酯经三光气催化得到中间产物 β-苄基-L-天冬氨酸 N-羧酸酐（BLA-NCA），随后与分子量为 5000的端氨基聚乙二醇（PEG，无特殊标注时 PEG均代指分子量为5000的聚乙二醇）或分子量为2000的端氨基聚乙二醇（PEG2k）通过聚合反应得到聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯共聚物（PEG-PBLA）。分别利用乙二胺（EDA）、二乙烯三胺（DETA）及三乙烯四胺（TETA）进行氨解后得到最终的阳离子亲水嵌段共聚物，分别为含乙二胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PEDA）、含二乙烯三胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PDETA）以及含三乙烯四胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PTETA）。　　2.含β-环糊精的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物的合成　　将合成得到的 PEG-PBLA 经炔丙胺（PPA）氨解后得到含炔丙胺的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PPPA），随后通过点击化学在一价铜离子的催化下合成得到含β-环糊精的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PCD），产物经透析法纯化。　　3.亲水嵌段共聚物的结构表征　　取适量阳离子亲水嵌段共聚物及 PEG-PCD 分别通过核磁、红外光谱及质谱进行聚合物结构表征，并计算聚天冬酰胺段的取代数量。　　4.亲水嵌段共聚物的初步生物安全性评价　　取大鼠红细胞进行体外溶血实验，通过拍照观察溶血现象，并测定波长为 570 nm与620 nm处的吸光度值，计算不同亲水嵌段共聚物的溶血百分数。　　昆明小鼠称重后，尾静脉注射给予500 mgkg-1亲水嵌段共聚物材料。注射后，记录体重并观察其基本生命体征。14 天后，处死小鼠取血样测定血常规，并取血清测定肝肾功指标。同时取小鼠主要脏器，计算脏器指数并进行组织病理学分析。　　5.静电作用纳米乳的制备及理化性能表征　　将不同的阳离子亲水嵌段共聚物溶于去离子水中，加入不同体积的脂肪酸后涡旋30 s，得到静电作用纳米乳。利用动态光散射法测定其液滴粒径，利用激光粒度仪测定其表面电位，油相经尼罗红标记后采用超高分辨率显微镜及激光共聚焦进行荧光观察，经戊二醛交联后利用透射电子显微镜观察纳米乳形态。　　6.包合作用纳米乳的制备及理化性能表征　　将PEG-PCD溶于去离子水中，加入不同体积的苄醇（BA）后涡旋30 s，得到包合作用纳米乳。利用动态光散射法测定其液滴粒径，利用激光粒度仪测定其表面电位，油相经尼罗红标记后采用超高分辨率显微镜及激光共聚焦进行荧光观察，经戊二醛交联后利用透射电子显微镜观察纳米乳形态。　　7.氢键作用纳米乳的制备及理化性能表征　　将聚乙二醇聚（N-异丙基丙烯酰胺）共聚物（PEG-PNIPAm）溶于去离子水中，加入不同体积的脂肪酸后涡旋30 s，得到氢键作用纳米乳。利用动态光散射法测定其液滴粒径，利用激光粒度仪测定其表面电位，油相经尼罗红标记后采用激光共聚焦进行荧光观察，经戊二醛交联后利用透射电子显微镜观察纳米乳形态。　　8.亲水性共聚物与油相分子间的相互作用的测定　　利用等温滴定量热法（ITC）测定亲水性共聚物与油相分子间的相互作用，同时得到亲和力及相关热力学参数，包括焓变、熵变及吉布斯自由能变。　　9.不同乳液体系的芘荧光光谱测量　　利用芘荧光探针法测定聚合物水溶液及乳液疏水性的变化。称取适量的聚合物材料配制不同浓度的水溶液及含不同体积油相的乳液样品，样品中芘的终浓度为6.0 × 10?7M。利用荧光光谱仪扫描芘的激发光谱与发射光谱，固定发射波长为390 nm扫描300 nm～360 nm激发光谱；随后固定激发波长为339 nm，扫描360 nm～460 nm发射光谱。　　10.界面张力的测量　　采用最大气泡法测定乳液中油水界面张力。根据杨-拉普拉斯公式，最大气泡时压力值将反应此体系中油水界面张力。考察聚合物浓度、油相体积分数等因素对油水界面张力的影响。　　11.纳米乳的初步体内安全性评价　　昆明小鼠称重后，口服灌胃给予 33 ml kg-1纳米乳。每天记录体重，观察其基本生命体征。 14 天后，处死小鼠取血样测定血常规，取血清测定肝肾功指标。 取小鼠主要脏器并称重，计算脏器指数，同时进行组织病理学分析。　　12.基于纳米乳模板制备不同结构的功能材料　　称取不同的聚合物溶于二氯甲烷，加入已制备好的纳米乳中，超声20 s后室温搅拌挥发溶剂得到不同结构的功能材料，采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察其微观结构。　　13.载药纳米乳的制备及表征　　称取一定量的难溶性小分子药物溶于苄醇，浓度为50 mgml-1，然后分别与1 ml浓度为10mg ml-1的PEG-PCD水溶液按照O:W=0.06:1涡旋30 s得到载药纳米乳。拍照观察外观，激光粒度仪测定粒径分布。　　14.体内药动学实验　　SD 大鼠经口服灌胃给予载药纳米乳后按时间点采集血浆，利用高效液相色谱法测定血药浓度，并采用DAS 3.0软件计算得到药动学参数。　　15.吲哚美辛（IND）载药纳米乳的体内抗炎疗效评价　　通过角叉菜胶诱导的急性足趾肿胀模型来评价吲哚美辛载药纳米乳在抗炎药物靶向治疗中应用，利用足趾容积测量仪测定各时间点足趾部位的肿胀度，评价急性炎症程度。　　16.紫杉醇（PTX）载药纳米乳的体内抗肿瘤活性评价　　A549细胞经裸鼠右后背部皮下接种，待肿瘤体积大小约 150 mm3时，静脉注射给予不同的紫杉醇制剂，评价其体内抗肿瘤活性；小鼠处死后取其心、肝、脾、肺、肾，计算其脏器指数，测定肝肾功指标和血脂水平的变化。　　17.纳米乳的炎症成像能力评价　　通过角叉菜胶诱导的急性足趾肿胀模型和脂多糖溶液滴鼻诱导的急性肺损伤模型来评价负载荧光染料Cy7.5的纳米乳在体内成像的效果。模型成功后尾静脉注射荧光纳米乳，随后利用活体动物成像系统进行小鼠在体成像或脏器离体成像。　　结果：　　1.基于聚乙二醇和天冬氨酸苄酯成功合成了一系列阳离子亲水嵌段共聚物（PEG-PEDA、PEG-PEDTA 及 PEG-PTETA）和含 β-环糊精的聚乙二醇聚天冬酰胺共聚物（PEG-PCD），通过核磁、红外确定了其结构，PEG-PEDA、PEG-PEDTA 及 PEG-PTETA中聚天冬酰胺段的取代度分别为 22、19及 16，PEG-PCD中聚天冬酰胺段的取代度为16。上述聚合物在体外无溶血反应，500 mgkg-1静脉注射剂量下对小鼠并未表现出明显的毒副作用或造成明显的病理变化。　　2.在亲水聚合物与油相共存的情况下，油水界面张力显著降低，溶液体系中芘荧光强度发生变化。同时，油相分子中相互作用段氢原子的核磁谱峰发生位移。　　3.随着油相体积分数的增加，体系中依次呈现胶束、囊泡以及纳米乳的结构形态。温度、聚合物浓度及结构的改变影响最终制备得到的纳米乳粒径及形态。　　4.利用适当浓度的亲水性共聚物水溶液与超过临界油相体积分数的油相分子成功构建非共价键作用纳米乳，包括静电作用、主客体包合作用及氢键作用，液滴粒径均小于200 nm。　　5.在纳米乳的基础上继续增加油相体积分数成功实现乳液的相反转，得到稳定的双连续相及反相乳液。　　6.基于静电作用纳米乳成功制备了 PLGA纳米粒，并增溶金属纳米晶体得到纳米金（银）的水分散溶液。基于包合作用纳米乳成功制备了聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒、聚己内酯（PCL）纳米粒及 PCL微球，并且得到了 PLGA、聚乳酸（PLA）、聚N-苯基丙烯酰胺（PNPAm）等材料的多孔聚合物结构。　　7.包合作用纳米乳能够增溶 IND、PTX等多种疏水性小分子药物形成载药纳米乳，体内药动学评价证明包合作用纳米乳能够明显增加 IND和 PTX的生物利用度，其药时曲线下面积为IND和PTX原料药的2倍和3倍。　　8.包合作用纳米乳负载荧光染料 Cy7.5 后在小鼠足趾肿胀模型中具有良好的成像功能。同时在小鼠急性肺损伤模型中通过离体脏器成像显示 Cy7.5荧光主要富集在肺组织。　　9.自组装纳米乳在 33 ml kg-1口服剂量下对小鼠并未造成明显的病理变化及表现出明显的毒副作用，具有较好的生物安全性。　　结论：　　1.成功构建了基于亲水性共聚物界面自组装纳米乳液体系，制备方法简便，条件温和，灵活性较好，可制备多种类型的稳定乳液，包括水包油型（O/W）、油包水型（W/O）单乳及水包油包水型（W/O/W）、油包水包油型（O/W/O）双重乳液。　　2.成功揭示了该自组装纳米乳的形成机制，即亲水性共聚物与相应油相分子基于非共价键作用后显著降低界面张力。同时发现了该纳米乳形成过程中经过了较短的胶束及囊泡过渡阶段。　　3.基于自组装纳米乳模板成功制备多种不同结构的功能材料，包括纳米粒、微球以及多孔有序的聚合物结构。　　4.包合作用纳米乳具有增溶疏水性小分子药物的能力，负载药物后显著提高其口服生物利用度，相比原料药具有更好的抗炎效果和抗肿瘤效果，同时降低药物副作用。另外，在负载荧光染料后对体内急性炎症病灶部位成像能力较好。　　5.基于非共价键作用力构建的自组装纳米乳具有较好的体内生物安全性。　　综上所述，本课题克服了传统乳化法的缺点，构建了一种新颖的基于亲水性共聚物界面自组装纳米乳液作为更加安全高效的体内药物递送系统。首次利用静电作用、氢键作用及主客体包合作用制备不含任何表面活性剂或胶体粒子的纳米乳液，制备方法简便，条件温和，乳液稳定性及生物安全性较好。以此为模板可制备多种聚合物纳米结构，同时可增溶疏水性药物后显著提高生物利用度，实现体内急性炎症的治疗及成像。该载药系统制备工艺简单，适用性强，应用范围广，在纳米材料与纳米医学领域均有着良好的发展潜力，为现代临床诊疗一体化提供有效的策略。