氯化锂及发育期牙胚根端复合体细胞条件培养液对脂肪干细胞增殖分化的影响

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目的分离培养发育期根端复合体(developing apical complex DAC)并收集上清,制备不同条件培养基用于培养脂肪干细胞,检测发育期根端复合体细胞上清液对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells ADSCs)增殖及分化的影响;研究不同浓度经典Wnt信号激活剂氯化锂(lithium chloride,Licl)对ADSCs增殖分化的影响,探索促进ADSCs增殖分化的最佳Licl浓度。方法利用组织块结合酶消化法培养出生后20天(postnatal20days PN20d)的SD大鼠下颌磨牙DAC,并运用形态学、组织学及免疫组化染色方法鉴定DAC组织,收集原代DAC细胞的上清通过过滤及不过滤的方法分别制备成不同的条件培养基(DACCM-滤和DACCM-未滤);MTT检测不同培养条件培养基对ADSCs增殖活性的影响;碱性磷酸酶活性检测及RT-PCR检测不同培养条件基对碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)蛋白活性及基因表达的影响。以不同浓度Licl(0mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、40mM)处理DACCM-未滤培养的ADSCs,MTT检测不同浓度Licl对ADSCs增殖能力的影响;ALP活性检测及RT-PCR检测ALP活性及ALP、BSP基因表达的影响。结果本实验成功分离培养了发育期根端组织复合体,HE染色指出发育期根端组织复合体取自牙根尚未发育完全的大鼠;细胞形态学观察发育期根端组织复合体细胞为长梭形间充质来源细胞和多角形的上皮来源的细胞混合组成;发育期根端组织复合体细胞免疫组化染色结果CK-14,vimentin阳性表达;发育期根端组织复合体上清分别经过滤和未过滤的方法制备了不同条件培养基;MTT分析结果表明发育期根端复合体细胞条件培养基-未滤(DACCM-未滤)培养的脂肪干细胞增殖活性明显高于普通培养基和发育期根端复合体细胞条件培养基-过滤(DACCM-滤)(P<0.05);普通培养基培养的脂肪干细胞增殖活性明显高于发育期根端复合体细胞条件培养液(过滤)组(P<0.05);ALP试剂盒检测ALP活性显示条件培养基(未过滤)培养的脂肪干细胞表达的ALP明显高于普通培养基和DACCM-滤组(P<0.05)。MTT结果表明5mM浓度Licl促进细胞增殖,明显高于其他各浓度组(P<0.05),40mM浓度Licl明显抑制细胞增殖(P<0.05);ALP活性检测结果表明5mM浓度Licl促进细胞ALP活性表达,明显高于其他各浓度(P<0.05),40mM浓度明显抑制细胞ALP活性表达(P<0.05);5mM浓度Licl明显促进细胞ALP、骨涎蛋白(bone sialoprotein BSP)基因表达(P<0.05),40mM浓度明显抑制细胞ALP、BSP基因表达(P<0.05)。结论取自牙根尚未发育完全的大鼠的发育期根端复合体,包含牙囊,牙乳头以及上皮根鞘;复合体细胞上清制备的DACCM-未滤对脂肪干细胞增殖分化均有明显促进作用;DACCM-滤对脂肪干细胞增殖具有抑制作用,但对细胞成骨分化也有一定的促进作用;一定浓度范围的Licl促进细胞增殖分化,其中以5mM作用最明显,浓度过高可对细胞产生细胞毒性作用,并抑制脂肪干细胞增殖分化。
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