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目的应用Lentivirus(慢病毒)构建钙离子/钙调蛋白依赖性激酶IIδ(CaMKⅡδ)过表达载体,以探索CaMKⅡδ过表达对破骨细胞分化以及下游信号分子环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)蛋白活性的影响,以进一步证实在破骨细胞分化中CaMKⅡδ的作用及调控破骨细胞分化的分子机制。方法1 CaMKⅡδ高表达转录本筛选及重组过表达载体构建。利用50ng/m L RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化,在诱导0d、1d、3d、5d后收获细胞。RT-PCR筛选出破骨细胞分化过程中稳定高表达的CaMKⅡδ转录本;并以之构建CaMKⅡδ过表达慢病毒载体,转染破骨细胞前体RAW264.7细胞,再用合适浓度的嘌呤霉素筛选出CaMKⅡδ过表达慢病毒稳定转染株。Real-time PCR和Western-blot检测CaMKⅡδ在细胞中表达。2 CaMKⅡδ过表达对破骨细胞生成、功能及下游分子活化T细胞核因子1(NFATc1)蛋白表达的影响。实验分成三组:对照组、空载体组和CaMKⅡδ过表达组;前者不用病毒转染,后两组分别转染空载体和重组过表达载体。三组细胞都用100ng/m L核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导细胞向破骨细胞分化;于第5d末收获细胞,应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及牙本质磨片吸收陷窝检测三组破骨细胞生成及骨吸收情况。应用免疫荧光细胞化学检测三组细胞中NFATc1蛋白表达情况。3 CaMKⅡδ过表达对信号分子CREB、ERK、JNK、p38蛋白活性的影响。实验分成两组:空载体组和CaMKⅡδ过表达组。Western-blot检测两组细胞在100ng/m L RANKL诱导下信号分子CREB在0h、1h、3h、6h、12h、24h时及ERK、JNK、p38在0min、5min、10min、15min、30min、60min时总蛋白和磷酸化蛋白水平。结果1 RT-PCR检测显示CaMKⅡδ转录本(transcript variant)2和3在破骨细胞分化中持续高表达。本研究采用转录本2成功构建了CaMKⅡδ过表达慢病毒载体,并建立了稳定转染细胞株。Real-time PCR和Western-blot证实了CaMKⅡδ在RAW264.7细胞中过表达,其中Real-time PCR检测过表达组CaMKⅡδm RNA的表达量较对照组、空载体组分别上升了149.6%(P<0.05)和95.3%(P<0.05);Western-blot检测过表达组CaMKⅡδ蛋白表达较对照组、空载体组分别上升了36.0%(P<0.05)和32.7%(P<0.05)。2经RANKL诱导5d后,CaMKⅡδ过表达组TRAP阳性破骨细胞的数目、牙本质吸收陷窝数和吸收陷窝的面积分别是22.600±3.362、3.000±1.225和1429.980±759.394mm2,与对照组(23.600±3.050、2.600±1.517、1477.160±778.798mm2)和空载体组(21.800±1.643、2.600±1.140和1322.720±225.484mm2)比较差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光细胞化学检测显示三组细胞中NFATc1蛋白荧光强度也没有明显差异。上述结果提示CaMKⅡδ过表达对破骨细胞生成、骨吸收功能及下游分子NFATc1蛋白表达无明显影响。3 CaMKⅡδ过表达在破骨细胞分化过程中对JNK、p38的蛋白磷酸化无显著影响(P>0.05);但CaMKⅡδ过表达下调了RANKL诱导10min、15min、30min、60min时ERK蛋白磷酸化(P<0.05);并使诱导0h、1h时CREB磷酸化蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论1本实验应用转录本2成功构建了CaMKⅡδ过表达慢病毒载体,并建立了稳定转染细胞株。2 CaMKⅡδ过表达对破骨细胞的分化、骨吸收及下游分子NFATc1蛋白的表达无明显影响。3 CaMKⅡδ过表达在破骨细胞分化中抑制了ERK蛋白磷酸化,并上调了CREB磷酸化蛋白水平;但对JNK、p38蛋白活性无明显影响。上述研究提示,高于生理水平的CaMKⅡδ虽然可以调节部分信号分子的活性,但不足以对破骨细胞分化及骨吸收功能产生影响。