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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)可导致鸡、鸭等多种禽类的肠道外疾病,临床症状复杂多样,包括心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎、败血症和脑炎等,该病波及范围广,严重制约着各地养禽业的健康发展。除了禽类,它还可以导致小鼠的脑膜炎症状,无疑对人类健康构成了潜在的威胁。毒力因子是APEC致病过程中的重要因素。已发现的APEC毒力因子主要包括黏附素、侵袭素、抗血清存活因子、铁摄取系统、空泡形成毒素以及其他毒力因子。有研究证明,APEC与人类肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC)利用共同的毒力基因贮存库,因此,加强对APEC毒力因子的监测和研究,对于养禽业和公共卫生均具有重要意义。APEC的致病力是由多种毒力因子共同作用的结果,新的毒力因子的发现将有助于APEC致病机理的阐述。Ⅵ型分泌系统(Type VI secretion system, T6SS)是新近发现的革兰氏阴性菌的蛋白分泌系统。研究证明,T6SS在不同菌中扮演多样的角色,包括促进毒力、抑制细菌的复制和毒力以及调节菌间关系等。目前,T6SS在APEC中的作用尚不清楚。本研究建立了4组多重PCR方法,用以检测APEC的18个毒力基因,另外还研究了T6SS2核心蛋白DotU在APEC致病以及蛋白分泌过程中的作用。1.禽致病性大肠杆菌毒力基因多重PCR方法的建立为实现对APEC毒力基因的简易、快速检测,本研究建立了4组多重PCR方法,分别检测黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因共18个毒力基因。根据GenBank公布的基因序列,设计合成18对特异性引物,通过退火温度、引物浓度等条件优化,建立了4组多重PCR体系,通过模板倍比稀释法检测了各组多重PCR的灵敏性。利用建立的多重PCR方法对100株APEC进行了毒力基因检测,验证多重PCR方法的可行性。试验结果显示,本研究建立的多重PCR方法能够特异性扩增出目的基因,其灵敏度分别为：103 CFU、103 CFU、105 CFU、 105 CFU细菌和1 ng、1 ng、10 ng、10 ng DNA。对100株APEC的毒力基因进行多重PCR检测,结果与先前的单基因PCR检测结果一致。试验结果表明,所建立的多重PCR方法快速、有效,可用于APEC毒力基因的鉴定及流行病学调查。2.禽致病性大肠杆菌DE719 T6SS基因的序列分析、流行病学调查及克隆表达T6SS是新发现的细菌蛋白分泌系统,其在APEC中的作用尚待研究。本研究根据NMEC RS218的T6SS序列对APEC DE719的T6SS进行了测序,并检测了核心基因dotU在75株APEc分离株中的分布。另外,对核心蛋白DotU、Hcp1和Hcp2进行克隆表达,并制备相应抗血清,为进一步研究DotU在APEC致病力以及蛋白分泌过程中的作用奠定基础。分析发现DE719 T6SS大小为23033 bp,结构与新报道的APEC T6SS2相似,故命名为DE719 T6SS2,其核心基因dotU的分布率为6.67%。另外,设计合成dotU、hcp1、hcp2的特异性表达引物,并进行扩增,通过双酶切定向克隆于原核表达质粒中,转化入表达宿主菌BL21(DE3),构建相应表达菌BL21-pET28a-dotU. BL21-pET28a-hcp1、BL21-pET30a-hcp2。经IPTG诱导,表达了大小依次为32 kD、23 kD和26 kD的融合蛋白。免疫新西兰大白兔获得相应多克隆抗体,经间接ELISA和Western blot鉴定,均具有较高的效价和良好的特异性。同时,通过间接ELISA试验发现DE719鸭康复血清中含有抗DotU抗体,说明DotU在感染过程中表达,并可刺激机体产生免疫反应,提示DotU可能在DE719的致病过程中发挥一定作用。3.禽致病性大肠杆菌DE719 T6SS2基因缺失株、互补株的构建及特性分析为研究T6SS2核心蛋白DotU在APEC DE719致病过程中的作用,本研究利用Red同源重组系统构建了DE719的dotU、hcp1、hcp2缺失株及T6SS2缺失株,并用pSTV28构建了dotU缺失互补株。通过一系列试验比较分析野生株、基因缺失株和互补株的生物学特性、致病力差异,同时还探究了dotU缺失对T6SS2蛋白分泌(Hcp1和Hcp2)的影响。生物学特性试验结果显示,与野生株相比,dotU缺失株的生长特性、运动性无显著变化；但其凝集沉降能力、对环境及SPF鸡血清耐受力显著下降。细胞试验结果显示,dotU缺失导致其对DF-1的黏附能力、对HD-11的抗吞噬能力和胞内存活能力显著下降。动物试验结果表明DE719△dotU对雏鸭的致病力、体内存活和定殖能力显著降低。对T6SS2分泌蛋白的分析发现dotU的缺失没有影响Hcp1的表达,但导致APEC不能向胞外分泌Hcp1。在野生株、dotU缺失株和互补株的培养基上清中均未检测到Hcp2。另外,对全菌感染的HD-11细胞进行荧光定量分析发现dotU缺失株组的IL-6和IL-8显著下调。