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目的:利用分子生物学技术,干扰Aha1的正常表达,分析干预前后斑马鱼运动能力、肌小节组分蛋白、肌球蛋白分子伴侣热激蛋白90(Hsp90α)和Unc45b的变化,探寻Aha1对肌小节组装的调控作用及其与Hsp90α、Unc45b的相互关系,以期为肌肉组装异常相关疾病的诊断治疗以及药物开发提供理论和实验证据。方法:运用分子生物学手段克隆Aha1基因,采用原位杂交及实时定量PCR技术检测Aha1基因在斑马鱼不同发育时期的表达和分布。采用TALEN、CRISPR-Cas9、si RNA、构建过表达载体等技术,通过显微注射的方法干扰斑马鱼Aha1的正常表达,采用测序及实时定量PCR等技术筛选Aha1基因受到干扰的斑马鱼,通过免疫组织化学染色的方法检测干预前后肌小节组分蛋白actinin的表达。行为学实验分析干预前后斑马鱼的运动能力改变。实时定量PCR法检测肌小节组装相关分子伴侣Hsp90α和Unc45b的变化,用以分析Aha1与Hsp90α、Unc45b的相关性。结果:通过原位杂交及实时定量PCR的方法确定:Aha1基因主要在斑马鱼骨骼肌及心肌中特异性表达,24 hpf时Aha1的两个同源基因ahsa1a和ahsa1b表达水平较高,故基本选取发育至24 hpf的斑马鱼完成之后的系列实验。利用TALEN基因敲除技术获得3个Aha1基因突变体品系,目标序列五个不连续碱基被敲除,且RT-PCR法证明TALEN突变体Aha1基因表达量降低;CRISPR-Cas9实验注射CRISPR ahsa1a、ahsa1a+ahsa1b-3、ahsa1a+ahsa1b-4组成功敲除掉ahsa1a基因目标序列的五个连续碱基;si RNA实验仅显微注射ahsa1b749组使ahsa1b的表达量降低;表达载体ahsa1a和ahsa1b注射斑马鱼实验中,两基因在斑马鱼骨骼肌及心肌中均发生过表达现象。免疫组化实验表明采用CRISPR-Cas9及si RNA技术干预斑马鱼Aha1基因后肌小节组装蛋白辅肌动蛋白actinin未发生明显变化。斑马鱼行为学实验表明Aha1基因发生突变或表达量减少会降低斑马鱼的运动能力及发育水平。分子伴侣表达量实验显示,TALEN突变体斑马鱼Hsp90α和Unc45b的表达水平均明显降低,注射si RNA 1b749和1a438+1b462组Unc45b的基因表达量降低,注射si RNA后Hsp90α表达水平未降低,结果表明Aha1作为一个辅助分子伴侣对肌小节的组装具有十分重要的作用。结论:本实验成功克隆了斑马鱼Aha1基因,检测出Aha1在斑马鱼肌肉特异性表达。实验成功筛选出Aha1基因突变体,且证实Aha1基因发生突变不仅会影响斑马鱼的发育及运动,也会使分子伴侣Hsp90α和Unc45b的表达水平降低,从而影响斑马鱼肌小节的组装。综上,Aha1基因作为一种肌小节组装的辅助分子伴侣,在肌无力和肌肉萎缩疾病防治中发挥重要作用。