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白血病干细胞被认为是白血病发生、发展及治疗后复发的根源，具有自我更新、增殖和分化等能力，并有自身特异的表型特征。近年来以白血病干细胞作为治疗靶巴点已成为白血病治疗的一种新策略，目前的研究主要针对白血病干细胞表面分子、细胞内信号通路及与微坏境的相互作用这三方面展开。溶瘤腺病毒已经广泛应用于基因治疗包括肿瘤的基因治疗，但是对白血病干细胞的溶瘤腺病毒治疗还少有进展。由于IL-3受体α链(CD123)在急性髓性白血病干细胞中表达，但在造血干细跑中不表达，因此可以作为特异性清除白血病干细胞的理想靶点。在此丛础上，本课题构建了sCAR-IL3融合蛋白，该融合蛋白的sCAR部分可与5型腺病毒结合，IL-3部分可与急性髓性白血病干细胞表面分子IL-3受体α链结合，从而介导5型腺病毒感染缺乏腺病毒受体的白血病干细咆。
融合蛋白的构建简述如下：抽提293细胞总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增扶得CAR基因并克隆至pMD18-Tsimple载体中，进行酶切及序列分忻。然后PCR扩增得到sCAR基因，克隆至pET-28a载体中，得到pET-28a-sCAR重组质粒。Linker合成后插入剑sCAR的下游，即得到重组质粒pET-28a-sCARL。为提高IL-3与其受体的亲和力，本课题还对其进行了突变改造，得到IL-3三种形式，包括：①全长IL-3、②第125-133位氨基酸缺失及③第125-133位氨基酸缺失并且116位出赖氨酸突变为色氨酸，基因经PCR扩增后，克隆至pET-28a-sCARL载体中，即得到融合蛋白基因的原核表达质粒。以其为模板用PCR方法获得sCAR-IL3融合蛋白基因，克隆至原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌M15中以终浓度为0.8mM的IPTG诱导表达，获得42KD左右融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在，稀释复性后经Ni离子亲和层析得到三种纯化的融合蛋白：①sCAR-IL3w、②sCAR-IL3[△125-133]和③sCAR-IL3[△125-133，K116W]。BCA法测定蛋白浓度为300μg/ml，Westernblot分析表明融合蛋白表达正确。
细胞实验中，对Kasumi-1细胞系的流式细胞术分析显示，其中的CD123+细胞绝大多数办表现为CD34+/CD38-，表明该细胞系中CD123+细胞群具有与急性髓性白血病干细胞相同的表面分子标记。将sCAR-IL3融合蛋白与腺病毒Ad-EGFP共同处理Kasumi-1细胞，以Ad-EGFP单独处理细胞作为对照，结果显示，融合蛋白可显著提高Ad-EGFP对Kasumi-1细胞的感染效率(P＜0.05)。以CD123抗体标记的流式细胞术结果显示，融合蛋白与Ad-EGFP共处理组显著提高了Ad-EGFP对CD123+细胞的感染效率(P＜0.05)。其中，融合蛋白sCAR-IL3[Δ125-133，K116W]提高腺病毒对CD123+Kasumi-1细胞的感染效率优于sCAR-IL3w和sCAR-IL3[Δ125-133](P＜0.05)。另外，融合蛋白未显著提高Ad-EGFP对CD123呈阴性的细胞系K562的感染系(P＞0.05)。
综上所述，sCAR-IL3融合蛋白可以成功介导5型腺病毒感染CD123+细胞也括CD34CD38-CD123+的白血病干细胞。此外，融合蛋白显示了CD123特异性。因此，融合蛋白sCAR-IL3可为今后利用5型溶瘤腺病毒靶向清除白血病干细胞提供一个新的治疗平台。