产耐热纤维素酶菌株的筛选及纤维素酶基因的克隆与表达

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mumuww
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从大田蘑菇种植场建堆的稻草样中分离得到一株具有较好的温度耐受性和pH稳定性的产纤维素酶放线菌DY3。综合形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,将其初步鉴定为嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)。对该菌产生的纤维素酶性质研究表明:该酶的最适催化温度为65℃;温度耐受性较好,在70℃保温60 min后仍有75%的活力;pH耐受范围较广,稳定性好,在pH7.5时CMCase和FPA酶活最高,在pH10.0的条件下处理60 min后仍有80%的活力;该酶的对羧甲基纤维素钠的作用最强,微晶纤维素次之,同时在以木聚糖为底物时有还原糖生成。   利用PCR的方法,从分离得到的菌株Thermobifida fusca DY3的基因组DNA中克隆到了其内切-β-1,4-葡聚糖酶基因,测序结果经在NCBI中的比对分析发现该基因与已经报道的Thermobifida fusca的全基因组序列中的一段序列及内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的完全密码子序列的同源性都达到了99%,但同时也存在一定的差别,说明该基因为新发现的、不同于己报道的来自Thermobifida fusca的纤维素酶基因。   通过对测序结果的分析发现,该序列为一个完整的开放读码框(Open ReadingFrame,ORF),以TGA翻译后对应的UGA为终止密码子,连续编码466个氨基酸序列,其对应的蛋白质的分子量约为50kD,与对表达产物的SDS-PAGE的图谱一致。将目的基因克隆到表达载体pET-28α上以获得表达质粒pET-28α-Cel,然后将表达质粒pET-28α-Cel转化BL21(DE3) plysS感受态获得工程菌株并用IPTG进行诱导表达,在IPTG诱导6h左右时,基因表达较好,表现出的CMCase活力为2.41IU/mL比原始发酵液酶活提高了近3倍。
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