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吸烟所导致的氧化应激是COPD重要的发病机制之一。谷胱甘肽(GSH)是体内重要的抗氧化物质，γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是GSH合成的限酶，通过调节γ-GCS的表达可以调节体内氧化和抗氧化的平衡状况，同时也能为临床治疗提供新的思路。本课题的研究目的：1、研究香烟的重要成分苯并(a)芘(B(a)P)是否通过影响γ-GCS的表达参与氧化/抗氧化失衡从而参与COPD的发病。2、寻找有效的抗氧化治疗药物。本研究分两部分：一、B(a)P对大鼠肺泡上皮细胞(CCL-149)γ-GCS的调控作用；二、大蒜素对CCL-149细胞γ-GCS的作用。
第一部分：B(a)P对大鼠肺泡上皮细胞(CCL-149)γ-GCS的影响目的：研究香烟中的重要成分B(a)P是否通过影响γ-GCS的表达参与氧化/抗氧化失衡从而参与COPD的发病过程。方法：一、MTT法观察不同浓度B(a)P(100ng/ml、500ng/ml、5000ng/ml)在不同时间(24h、36h、48h、72h)对CCL-149生长的影响，确定作用细胞的合适浓度。二、用EMSA(supershift)方法证明B(a)P刺激能够使AhR-ARNT(芳香烃受体-芳香烃核转位因子)形成异源二聚体，并结合E-box元件。三、B(a)P对CCL-149γ-GCS的影响：l、观察B(a)P对细胞γ-GCS基因转录水平的影响：(1)、将GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc质粒转入CCL-149细胞，以转染后6小时换用含血清培养基为计时点，于换培养基后2h、6h、12h、24h检测荧光素酶活性观察E-box元件的负性调控作用。(2)不同浓度B(a)P(2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml)作用于GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc表达载体，刺激不同的时间(2h、6h、12h、24h)观察其对γ-GCS表达水平的影响。(3)、用大鼠重组细胞因子TNF-α作为阳性对照，观察结果。(4)、用TCDD(10pmol/L)刺激转染GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc表达载体的大鼠肺泡上皮细胞，于不同的时间(2h、6h、12h、24h)检测其荧光素酶活性变化。2、B(a)P(20ng/ml、200ng/ml)刺激细胞(6h、12h、24h)，提取总蛋白用WesternBlot检测GCLC蛋白的变化。3、B(a)P(200ng/ml)刺激后(3h、6h、12h、24h、48h)检测细胞内GSH的变化。四、以NIH3T3为模型转染GCLC-luc，B(a)P(200ng/ml)作用后(2h、6h、12h、24h、48h)检测其荧光素酶活性的变化。五、B(a)P对GCLC基因上游的其他调控元件作用的研究及实验误差的排除：1、将含有NF-κB及AP-1转录因子通用调控序列驱动的载体转染入CCL-149，用B(a)P(200ng/ml)作用细胞(2h、6h、12h、24h)后观察其对NF-κB及AP-1两个正性调控位点的作用。2、按GCLC上游调控序列重构含E-box元件、CDXA元件及CDXA-E-box元件三个重组载体，将这些载体分别转染入CCL-149细胞，转染6小时后予B(a)P200ng/ml刺激细胞2h、6h、12h、24h，通过荧光素酶活性测定观察B(a)P对于E-box元件、CDXA元件以及E-box-CDXA的联合元件的协同作用来发挥作用。3、将GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc分别送检测序。结果：一、MTT法表明B(a)P的刺激浓度在5000ng/ml以上时严重影响CCL-149的生长(P＜0.01)，本课题根据MTT结果及参考文献常用剂量，选用小于500ng/ml的B(a)P作为刺激浓度。二、Supershift证实B(a)P刺激能够使AhR-ARNT形成异源二聚体，并结合E-box元件。三、1、B(a)P在总的转录水平不影响γ-GCS的表达：(1)、缺失E-box元件的GCLC-delE-box-luc其荧光素酶活性较GCLC-luc明显增高(P＜0.05)。(2)、不同浓度(2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml)B(a)P刺激不同的时间(2h、6h、12h、24h)不影响GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc的表达(P＞0.05)。(3)、用TNF-α作为阳性对照的结果提示TNF-α刺激12h、24h明显增强γ-GCS的表达(P＜0.05)。(4)、TCDD(10pmol/L)刺激不同的时间(2h、6h、12h、24h)不影响荧光素酶活性(P＞0.05)，提示TCDD对γ-GCS表达水平无影响。2、WesternBlot检测结果提示苯并芘刺激组在各个时间点GCLC蛋白的变化与对照组比较无明显差异(P＞0.05)，TNF-α在刺激24小时GCLC蛋白表达较对照明显增强(P＜0.05)。3、B(a)P(200ng/ml)刺激后(3h、6h、12h、24h、48h)检测细胞内GSH的变化与对照组比较无明显差异(P＞0.05)。四、用NIH3T3转染的结果表明苯并芘刺激组与对照组比较荧光素酶活性表达差异无统计学意义(P＞0.05)。五、B(a)P对GCLC基因上游其他调控元件的作用研究：1、B(a)P作用后NF-κB-luc和AP-1-luc的荧光素酶活性较对照组相比较，其荧光素酶活性的差异没有统计学意义(P＞0.05)，结果表明B(a)P不通过NF-κB及AP-1两个调控位点起作用。2、经测序后证实成功构建E-box-PGL3、CDXA-PGL3以及CDXA-E-box-PGL3三个重组质粒。苯并芘对这三个重组质粒的荧光素酶活性较对照组相比较差异没有统计学意义(P＞0.05)，表明B(a)P不通过E-box元件、GCLC基因E-box元件上游的调控元件CDXA及E-box-CDXA的两个调控元件的协同作用调控γ-GCS的表达(P＞0.05)。3、测序结果正确。结论：B(a)P刺激能够使AhR-ARNT形成异源二聚体，并结合E-box元件；在总的转录水平及蛋白表达水平B(a)P不影响γ-GCS的基因转录及蛋白表达；在CCL-149中，B(a)P原形不影响细胞内的GSH水平；成功构建三个重组载体，对这些载体荧光素酶活性检测表明B(a)P不影响E-box元件的表达。
第二部分：大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ-GCS的影响目的：寻找有效的抗氧化治疗药物。方法：一、MTT法观察不同浓度的大蒜素(0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)在不同时间(24h、36h、48h、72h)对CCL-149生长的影响，确定合适的作用浓度。二、用大蒜素(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml)刺激细胞，作用后6h、12h、24h、48h检测CCL-149细胞内GSH含量的变化。三、用大蒜素(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μ/ml)分别刺激细胞6h、12h、24h后收集细胞，提取总蛋白，用Western印迹实验观察大蒜素对CCL-149细胞γ-GCS蛋白表达的影响。四、用大蒜素作用于转染不同调控位点的报告基因载体(GCLC-delE-box-luc、CDXA-PGL3、E-box-PGL3、CDXA-E-box-PGL3、AP-1-luc、NF-κB-luc)的CCL-149，观察大蒜素可能的作用位点。五、用大蒜素(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml)刺激细胞，作用后6h、12h、24h、48h检测CCL-149细胞内MDA含量的变化。结果：一、MTT结果显示大蒜素浓度达到10μg/ml时引起细胞死亡(P＜0.01)，本课题根据MTT结果及参考文献常用剂量，选用大蒜素小于等于5μg/ml作为刺激浓度。二、不同浓度大蒜素(0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml)处理CCL-149后细胞内γ-GCS的蛋白表达较对照组增强(P＜0.05)，未表现剂量依赖性(P＞0.05)。三、1、通过报告基因系统表明大蒜素(1.0μg/ml)能上调GCLC的基因表达(P＜0.05)。2、通过报告基因系统表明大蒜素(1.0μg/ml)不影响AP-1结合元件，E-box元件、E-box-CDXA联合元件的表达；能促进CDXA元件的表达(P＜0.05)；在2h、6h抑制NF-κB元件的表达(P＜0.05)，24h促进NF-κB元件的表达(P＜0.05)。四、不同浓度大蒜素(0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml)处理CCL-149后细胞内MDA值较对照组降低(P＜0.05)，随大蒜素浓度的增大MDA表现有下降的趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：大蒜素在CCL-149中能上调γ-GCS的表达，提高细胞内GSH水平，降低MDA含量。