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基因点突变检测是分子生物学领域的一个重要话题。传统的点突变分析中常采用放射性元素、荧光色素以及酶标记等基因探针,这些探针都存在着如环境污染,光漂白及容易降解等不足之处。近年来,纳米金探针作为一种新型的基因探针,已引起了广泛的关注。该探针具有优良的光谱特征和光化学稳定性,对特征分子的非特异性吸附小,与生物大分子结合后不改变其活性。将纳米金探针用于基因点突变检测,可望发展成一种简便、低成本的基因点突变检测方法。
本文的内容包括:研究纳米金在盐溶液中的聚集现象,单链DNA与纳米金的相互作用,单链DNA和双链DNA与纳米金不同的静电作用,PCR反应成份对纳米金聚集的影响,及等位特异性PCR结合纳米金比色法检测K-ras基因点突变等实验内容。
实验证明,一定量的盐溶液会导致纳米金聚集,而纳米金的聚集会导致纳米金的光学性质发生改变。溶液的等离子吸收带向长波长方向移动,同时颜色由红色变成蓝色。进一步验证了单链DNA能被吸附到纳米金表面,且表面吸附的单链DNA越多,纳米金在一定浓度的盐溶液中抗聚集能力越强。随后证明了纳米金与单链DNA和双链DNA间存在不同的静电作用,加入一定量的盐溶液后,纳米金在两者的溶液中有不同的聚集现象。
基于上述实验结果,设计了一种简便的K-ras基因点突变检测方法。先对样品进行等位特异性PCR。经过扩增后,突变型样品的扩增产物中绝大部分是双链DNA。而野生型样品中的扩增产物绝大部分是没有被消耗的单链引物。在样品中依次加入纳米金和盐溶液后,两者在吸收光谱和颜色上存在差别,由此区分两种不同的基因类型,从而实现检测基因点突变的目的。文中还研究了PCR反应成份对实验结果的影响。结果表明,PCR缓冲液对纳米金聚集有一定的影响;但是当盐浓度增大时,最后通过对扩增样品进行凝胶电泳分析,结果和本方法一致,从而证实了该方法的可靠性。