磷酸化是最常见和最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化的可逆过程参与了几乎所有的生物学过程。高通量、高灵敏度的磷酸化蛋白质组学技术为系统地分析蛋白质磷酸化及其动态变化提供了强有力的技术手段。本论文主要目的就是在现有磷酸化蛋白质组技术的基础上，发展和优化新的磷酸化蛋白质组学分析技术流程，并应用于小鼠T细胞的分化模型中。　　本研究的第一章，主要从样品前处理、多肽的预分离、磷酸化肽段的富集、串联质谱检测、数据分析几个方面对现有的磷酸蛋白质组学技术进行简要的综述。　　本研究的第二章，对磷酸化蛋白质组学主要技术流程的各个阶段进行了比较和优化。在样品制备阶段，建立了超滤辅助的顺序酶切样品前处理方法，增加了对传统胰蛋白酶酶切无法鉴定到的磷酸化位点的检测。在多肽预分阶段，建立了一种简便，快速，基于碱性HLB固相萃取的预分方法，缩短了样品预分离的步骤和时间;在磷酸化肽段富集策略中，发现了谷氨酸和天冬氨酸作为非磷酸化肽段的竞争性富集抑制剂联合使用，能有效的提高二氧化钛富集磷酸化肽段的富集特异性;在质谱检测阶段，通过比较不同质谱仪的CID，MSA，HCD三种碎裂模式下磷酸化肽段的鉴定数目，发现采用离子阱检测的速度优势要比采用Orbitrap检测的质量精度优势在磷酸化肽段鉴定数目方面更为重要。对于LTQ Orbitrap XL质谱仪，ITCID是其检测磷酸化肽段的最佳碎裂模式，而对于Oribtrap Fusion质谱仪，ITHCD则是其检测磷酸化肽段的最佳碎裂模式。在数据分析阶段，发现天冬酰胺和谷氨酰胺脱氨作为可变修饰能够提高磷酸化肽段的鉴定效率，并建立了基于PhosphoRS的磷酸化位点计数策略和依据蛋白质的相对定量信息来校正磷酸化位点定量信息的方法。　　本研究的第三章，我们旨在建立一种磷酸化和糖基化两种翻译后修饰同时富集的方法。发现二氧化钛在同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段时对糖基化肽段的富集能力较低，并且富集的糖基化肽段具有较高的假阳性。我们系统地比较了除二氧化钛以外的酰肼法和凝集素法两种糖基化富集方法，结果显示凝集素法的富集能力更强。因此，我们在磷酸化肽段富集前，采用了凝集素法富集糖基化肽段，这样会显著提高后续磷酸化肽段富集的数目。我们进一步比较了磷酸化肽段和糖基化肽段同时富集的并联策略和两种串联策略，发现串联富集策略样品使用量虽只有并联策略的一半，却能在第二步富集时鉴定到更多的翻译后修饰肽段。特别是以凝集素法作为第二步富集的串联富集方法，还能够显著减少凝集素富集糖基化肽段的假阳性率。　　第四章，我们结合基于SILAC标记的定量蛋白质组学技术，将优化后的磷酸化富集流程、磷酸化和糖基化串联富集策略应用到小鼠CD+8 T细胞分化的模型中。首先，系统地比较了效应T细胞和记忆T细胞磷酸化蛋白质组，共鉴定到9407个蛋白，其中磷酸化蛋白4359个，磷酸化位点22894个，高可信度磷酸化位点14629个。定量磷酸化蛋白3411个，其中同时具有蛋白表达量和磷酸化位点变化量信息的蛋白2762个，这些蛋白通过蛋白表达量的校正得到具有磷酸化修饰比率变化的位点9588个。结果表明效应性T细胞中PI3K-Akt、mTOR，HIF-1α等信号通路可能处于相对激活的状态，而在记忆T细胞中TCR，Ras-MAPK、P53等信号通路可能处于相对激活的状态。然后，我们比较了活化T细胞和效应T细胞的蛋白质组，磷酸化蛋白质组和糖基化蛋白质组。共定量到6552个蛋白，其中5598个蛋白具有蛋白表达量信息，2193个蛋白具有磷酸化定量信息，741个具有糖基化定量信息。同时具有三种定量信息的蛋白59个。为进一步研究糖基化修饰，磷酸化修饰与蛋白表达的共同调控机制的提供可能的线索。