体外培养法增生期血管瘤裸鼠动物模型的建立

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目的:(1)了解血管瘤内皮细胞体外培养的生长规律,通过体外培养法人增生期血管瘤裸小鼠动物模型的建立,以其能客观、真实地反映人血管瘤的临床发生、发展过程。为进一步研究血管瘤的发病机制以及利用它进行血管瘤靶向治疗的临床研究提供一个良好的平台。  方法:(1)血管瘤内皮细胞体外培养:无菌条件下取新鲜血管瘤组织去除皮肤及多余脂肪,剪碎,接种于培养瓶底壁。加入M199培养液,将培养瓶置于培养箱内。待血管瘤内皮细胞从组织块四周贴壁生长,汇合成片铺满瓶底即可传代。期间在相差显微镜下动态观察并记录细胞生长情况、绘制血管瘤内皮细胞生长曲线。(2)细胞种植裸小鼠动物模型建立:血管瘤内皮细胞经过体外3~6次的传代,浓集后分别种植于裸小鼠双侧胸壁、双侧腰部皮下组织内。植入完成后自然生长,每周定期观察移植瘤生长情况。于种植后第1、2、4、8、12周用游标卡尺测量肿瘤最大直径a及横径b,根据公式V=π/6×a×b2估算肿瘤体积变化。(3)瘤体组织的鉴定:动物模型建立后第8周和12周,切取瘤体组织进行CD31、CD34免疫组化检测及其阳性细胞计数,以及光镜下对瘤体形态学观察。(4)相关数据进行统计学处理。  结果:(1)体外培养血管瘤内皮细胞(VEC)生长情况:组织块接种于培养瓶中,48h~72h后即可见有内皮细胞以组织块为中心向四周呈放射状移出贴壁生长,一周以后发现移出细胞开始分裂生长,两周后细胞生长速度加快,1~2天换次培养液,三周后内皮细胞铺满培养瓶瓶底。在相差显微镜下可见细胞呈单层分布,多角形或短梭型或椭圆型,典型“鹅卵石”样表现。细胞计数为3*108个/培养瓶。(2)瘤体生长情况:在模型建立8周时间,除一只裸鼠出现体重减轻,活动减少,精神萎靡。其余小鼠均存活良好,食欲旺盛、反应敏捷、活动有力。所形成的瘤体呈浅粉红色,质韧,切开表皮发现瘤体被包膜包绕,境界清楚,血供丰富,出血较多。所种40处瘤体存活率87.5%(35/40)。在第1周内,种植的内皮细胞所形成的包块体积进行性缩小甚至完全吸收。第2周以后,发现有瘤体渐进性增长,第2周到第4周时间内瘤体体积增长缓慢,4周~8周瘤体体积增长较快。8周以后种植瘤体的再次进入生长缓慢期,瘤体相继缓慢缩小,颜色变浅。瘤体组织鉴定:组织切片HE染色,光镜下,第8周可见血管瘤内皮细胞数目多,局部细胞核密集,可见丰富毛细血管管腔镶嵌其中。第12周可血管瘤内皮细胞数目减少,部分聚集成团。大量纤维组织和脂肪细胞镶嵌其中。所切瘤体作鼠抗人CD31、CD34单克隆抗体标记,第8周其阳性指数分别为:92.43±5.56﹙﹢﹢﹢﹢﹚,92.53±5.01﹙﹢﹢﹢﹢﹚,第12周其阳性指数分别为:72.23±10.745﹙﹢﹢﹢﹚,65.89±18.69﹙﹢﹢﹢﹚,正常裸鼠肌肉组织抗体标记为阴性表达。两个样本数据的比较,采用配对t、P检验分析,P值分别为0.02、0.03<0.05,显示有显著性差异。  结论:(1)血管瘤是一种良性肿瘤,其发生发展主要是血管内皮细胞增生所致。(2)血管瘤内皮细胞体外培养所生成的细胞株,经过浓集种植到裸小鼠皮下可以再生成血管瘤。(3)运用血管瘤特异性的标志物鼠抗人 CD31、CD34单克隆抗体标记种植所形成的瘤体,结果显示种植所形成的瘤体细胞,来源于人血管瘤内皮细胞,而非裸鼠本身。(4)成活的血管瘤瘤体与原人体血管瘤比较,其血管瘤的生物学和病理特征基本一致,可以观察到从发生到迅速增殖再到消退的类似人血管瘤演变过程。为进一步研究血管瘤的发病机制以及利用它进行血管瘤靶向治疗的临床研究提供一个良好的平台。
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