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目的:探究在胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的作用下,人牙髓细胞体外及裸鼠体内的增殖、分化情况。方法:本实验选取因阻生或者正畸减数拔除的健康恒牙(经患者知情同意),采用组织块酶消化法分离、提取人牙髓细胞并进行原代培养,当细胞增殖达到培养瓶底的80%时,用0.25%胰蛋白酶消化并且传代,选取第四代人牙髓细胞作为种子细胞进行以下实验:1 IGF-1对人牙髓细胞体外增殖的影响以2×10~4个/孔人牙髓细胞接种于96孔培养板中,按照5行×5列,共25个孔的规格进行接种,共接种4个板。细胞培养24小时后,吸净培养液,每一列为一组,实验组分别用含2%血清浓度的50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlIGF-1培养液继续培养,对照组用含2%血清浓度的培养液培养,每三天更换一次培养液,分别于第1天、第3天、第5天、第7天采用MTT法检测细胞的体外增殖情况。MTT法检测具体如下:每孔加20μl甲基噻唑基四唑(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT),4小时后吸净培养液,每孔加150μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液,酶标仪以450nm波长检测各孔吸光度(OD)值。2人牙髓细胞在裸鼠体内的增殖分化情况1)人牙髓细胞接种于脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)支架:将ADM支架置于灭菌好的生物安全柜中,裁剪成1cm×1cm×1cm大小,放入48孔板中,加入100μl胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)预湿,并放置于CO2恒温箱中24小时,24小时后吸净培养液备用。选取第四代人牙髓细胞,制备成2×10~5个/ml人牙髓细胞悬液,采取点种接种的方式将人牙髓细胞接种到ADM支架上,静置半小时,使人牙髓细胞充分进入到ADM支架的孔隙中,再加入含100ng/mlIGF-1的矿化液(含10%FBS的DMEM,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,100mg/ml维生素C,10 nmol/L地塞米松)1ml,培养3天;2)ADM支架移植到裸鼠体内:选取4周龄的免疫缺陷鼠,在无菌条件下切开其左背部皮肤,血管钳钝性分离,伤口长约1cm,将用含100ng/mlIGF-1的矿化液培养过3天的adm支架-人牙髓细胞复合体移植到裸鼠左背部皮下,并拉拢缝合,该侧为实验侧;同样方法切开右侧背部皮肤,钝性分离,将空白支架移植到裸鼠右背部皮下,并拉拢缝合,该侧为对照侧。饲养2周后麻药过量处死一半裸鼠,饲养4周后麻药过量处死另一半。处死后立即将裸鼠体内支架复合物取出,部分进行冰冻,然后切片,进行he染色,茜素红染色,masson三色法染色,于光学显微镜下观察。部分支架复合物立即放入4%戊二醛溶液中固定,制备超薄切片,透射电镜观察;3)用spss21.0统计软件,数据结果以均数±标准差表示,采用单因素方差分析及s-n-k法进行统计学分析,p<0.05为有统计学意义。结果:1通过组织块酶解法,在体外成功分离并培养出了人牙髓细胞,免疫组化法结果提示波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证实人牙髓细胞来源于中胚层间充质细胞。2通过mtt法检测IGF-1不同浓度(50~100ng/ml)对人牙髓细胞增殖的影响,结果为人牙髓细胞培养至第5天和7天时,IGF-1组增殖均高于对照组(p<0.05),并随着浓度的升高,细胞增殖越明显,100ng/mlIGF-1组细胞增殖最显著(p<0.01)。3将adm支架-牙髓细胞复合物移植到裸鼠体内后,分别培养2周、4周后,取出支架-细胞复合物部分进行冰冻切片:he染色,可见大量的成纤维细胞;茜素红染色能够看见明显的矿化结节;masson三色法染色提示蓝染的胶原纤维。4将在裸鼠体内培养了2周、4周后的adm支架-细胞复合物取出,制备成超薄切片,采用透射电镜观察,结果显示:细胞内大量线粒体,高尔基体复合物,同时能够看到胶原纤维。结论:1通过组织块酶消化法成功培养出了人牙髓细胞,经过免疫组化法鉴定细胞来源于中胚层间充质干细胞,选取增殖能力强,细胞形态好的第四代人牙髓细胞作为种子细胞,符合实验要求。2人牙髓细胞对IGF-1具有浓度依赖性,在50ng/ml~100ng/ml浓度范围促增殖作用明显,且IGF-1为100ng/ml浓度时,细胞增殖最明显。3 ADM支架-人牙髓细胞复合物经裸鼠体内培养后,制备冰冻切片及超薄切片,经光学显微镜观察及透射电镜,证实IGF-1可以在体外及裸鼠体内促进人牙髓细胞的增殖分化。