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随着全球温度的升高,农作物的热胁迫逐渐成为全球性的农业问题。持续的高温天气导致了植物体内一系列的生理生化的变化,而这些变化将会影响植物生长和发育,这将有可能直接导致巨大的经济损失。毫无疑问,不断加剧的温室效应同样威胁到了我国最重要的粮食作物——水稻的生长发育和产量。已有研究表明,籼稻(Oryzasativa Linn. subsp. indica)品种黄华占在其孕穗期,扬花期和灌浆期均具有较强的耐热性。
本研究分别对黄华占、丰新占(热敏感籼稻品种)苗期和水稻扬花期进行高温处理,然后分别取常温对照和高温处理的水稻苗期叶片和水稻扬花期花药提取总蛋白,并通过双向电泳(2-DE)分离,继而通过比对图像找出高温胁迫下的差异表达蛋白。使用MALDI-TOF/TOF MS结合数据库检索这些差异蛋白,并对它们的功能进行归类,再通过半定量RT-PCR分析这些差异表达蛋白对应的mRNA在低温胁迫后的变化。此外,本研究还研究了高温对水稻苗期生理的影响以及高温对扬花期处理后水稻结实率情况。主要研究结果如下:
1.水稻苗期高温处理3d恢复正常条件培养5d后的成活率统计的结果显示,黄华占经过处理之后仍能保持50%~70%的成活率,比经过同样处理的丰新占(20%~30%成活率)表现出更强的苗期耐热性。
2.水稻扬花期高温处理7d恢复正常条件培养至种子成熟的结实率统计的结果显示,黄华占经过处理之后仍能保持50%以上的结实率,比经过同样处理的丰新占(4%结实率)表现出更强的扬花期耐热性。
3.受到高温胁迫30h后,黄华占苗期的MDA(丙二醛)含量没有明显变化,而丰新占苗期的MDA含量为正常情况下的1.36倍。说明黄华占比丰新占更能抵抗由高温引起的氧化伤害。
4.通过测定抗过氧化物酶系的各个酶活发现:在两个品种中,各个酶的酶活均有不同程度的增加,其中过氧化物酶(POD)在耐热品种中热胁迫后有显著提高,这说明过氧化物酶系在高温胁迫中维系耐热品种耐热的作用可能与过氧化物酶消除过氧化物有关。
5.2-DE及图像分析发现,苗期共有15个蛋白点在黄华占高温处理6h后特异上调,扬花期共有13个蛋白点在黄华占高温处理36h后特异上调。
6.对上述28个差异蛋白进行MALDI-TOF/TOF MS鉴定,成功鉴定其中22个蛋白,并根据数据库中与他们功能相关的信息,将上述蛋白按照功能划分为分子伴侣和热激蛋白、光合作用、柠檬酸途径、胁迫响应、其他等五个组,并对这些差异蛋白在高温胁迫应答中可能行使的功能进行分析和讨论。
7.采用半定量RT-PCR对上述22个差异变达蛋白进行分析的结果显示:有部分差异表达的蛋白对应基因的mRNA水平与蛋白水平的变化程度并不一致,推测这些差异蛋白可能还受到转录后水平的调控。
8.制备 Fumarate hydratase1, Isocitrate/isopropylmalate dehydrogenase, Pyruvate/2-oxoglutarate dehydrogenase,Hsp20,Hsp18等差异蛋白的多克隆抗体,通过Western杂交对它们的蛋白水平的表达量进一步确认。
本研究通过蛋白组学技术分析了耐热品种黄华占苗期叶片和扬花期花药在高温处理前后蛋白表达的变化,发现了一些黄华占高温特异上调的蛋白。经过分析发现,苗期叶片中耐热的系统里主要围绕着叶绿体与光合系统进行的,而扬花期花药中耐热的系统里主要围绕着线粒体、TCA循环、电子传递链进行的。同时我们推测分子伴侣、热激蛋白极有可能是这两大系统在高温胁迫下的保护者和维修者。这些结果对进一步探讨水稻耐热机制及确定新的耐热基因有着重要的意义。