特定蛋白由于具有特定的构象,因而具有特定的pI和疏水性,以及特定的免疫反应。特定的疏水性体现在该蛋白会在特定的硫酸铵饱和度中沉淀下来。但实际上,目前发现,同一蛋白,如乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15,GO),以及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39,Rubisco)等具有多个pI、和不同疏水性,即可以沉淀在一个范围的硫酸铵溶饱和度中,以及不同蛋白之间经常出现免疫交叉反应。同一蛋白呈现不同的pI和不同疏水性,表明同一蛋白具有多个构象；而不同蛋白的免疫交叉则表明,这些蛋白之间具有类似的构象,至少有类似的抗原表位。　　 目前并不清楚同一蛋白为何具有多个pI和不同疏水性。另外,蛋白质之间的免疫交叉反应非常普遍,即使单抗也不能完全避免。许多研究表明这种交叉反应是不可避免的,因为约5个氨基酸就构成一个抗原决定簇。从理论上讲,相同抗原决定簇有可能出现在结构完全不同的蛋白中。免疫交叉反应通常缺乏重复性,导致人们很难研究其中的原因。　　 本实验室在研究GO为何具有不同pI时发现,富含苯丙氨酸的碱性短肽(A basic phenylalanine-rich oligo—peptide,BOP)通过离子键和疏水作用与乙醇酸氧化酶相结合,形成GO—BOP复合体GC。GC在IEF中,BOP与GO不规则解离,导致GO具有多个pI,甚至pI呈现出一个范围。但该结果是在实验条件下得出的,在自然状态下的Go与BOP是否也以不同的比例结合,由于BOP是富含疏水性苯丙氨酸的碱性短肽,导致这些GC具有不同pI,以及不同疏水性。为此,本论文对其进行研究。　　 本实验室研究还发现,SDS—PAGE30min后,BOP出现在负极缓冲液中,SDS-PAGE60min后,负极缓冲液中BOP的含量下降。因此,我们推测BOP具有特殊的电泳行为,即可能会先由正极向负极泳动,再由负极回到正极,另外BOP具有强疏水性,可与很多蛋白相结合。同时BOP大量和普遍存在于动植物和微生物中。我们认为BOP在SDS—PAGE时可以和相邻泳道中的蛋白结合,进而导致相邻泳道中的蛋白的免疫特性发生改变。为此,本论文对其进行研究。　　 本论文发现:　　 1)以菜心绿叶粗蛋白为材料,经15％-35％硫酸铵分级沉淀,得到不同疏水性的GC。GC经DEAE-cellulose离子交换柱层析,获得不同pI的GC2-GC9。全波长扫描结果显示GC2、GC3、GC4、GC5在220nm和257nm呈现吸收峰；GC6、GC7、GC8、GC9除了在220nm呈现吸收峰外,还分别在259nm、271nm、273nm、273nm呈现吸收峰。GC2和GC4中苯丙氨酸的含量分别为9.2％和5.9％。时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)结果显示GC2-GC9与GC抗体反应有明显的区别。以上结果表明自然状态下的GO与BOP同样以不同比例结合,导致了GC具有不同的疏水性和pI,使得GO在一个范围的硫酸铵饱和度中沉淀。　　 2)SDS-PAGE Western-blot结果显示,BOP和GO40KD亚基以三种不同的方式结合:　　 (1)第一种方式是BOP完全包裹在GO亚基的外部,但是不掩盖GO亚基的抗原表位,形成的这种亚基复合体既可以被GO40KD亚基抗体识别,又可以被GC抗体识别。　　 (2)第二种方式是BOP和GO40KD亚基部分结合,以这种方式结合的GO亚基其中一部分被GC抗体识别,剩余的部分被GO40KD亚基抗体识别。　　 (3)第三种方式是BOP与GO40KD亚基不结合,这样的GO亚基只能被GO40KD抗体所识别,而不被GC抗体识别。　　 3)本文首次发现,BOP在SDS-PAGE中具有特殊的电泳行为,既可以先从正极向负极泳动,再由负极回到正极。BOP由负极回到正极的时候,不仅存在于原来的泳道中,而且还出现在相邻的其他泳道中。为研究BOP特殊电泳行为对相邻泳道的其他蛋白免疫特性的影响,将菜心粗蛋白,GC等含有BOP的蛋白,以及不含BOP的BSA分别与Marker进行SDS-PAGE Western-blot,结果显示与BSA一组的Marker不能被GC抗体识别,而与菜心粗蛋以及GC一组的Marker的都能够被GC抗体识别。以上结果就表明BOP在SDS-PAGE时影响了其他泳道蛋白的免疫特性。　　 因此,本文认为正是由于BOP与蛋白以不同比例的结合,使同一蛋白具有不同的疏水性,导致同一蛋白在一个范围的硫酸铵饱和度中沉淀。同时BOP在SDS-PAGE时先从正极向负极泳动,再由负极回到正极的特殊电泳行为,以及BOP强的疏水性,导致了相邻泳道中蛋白免疫特性的改变,进而引起免疫交叉反应的发生。