研究背景:随着饮食习惯和生活方式的改变,高脂血症已成为一个重要的公共健康问题。临床上常用治疗高脂血症的药物,长期应用会出现不同概率、不同程度的不良反应,因此需要探索新的治疗方法,近年来中草药的降脂作用受到了越来越多的关注。本课题组前期研究发现黄连、吴茱萸的主要有效成分小檗碱和吴茱萸碱1:1配伍可显著降低血浆甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平,减轻高脂模型大鼠肝脏组织脂肪变性情况,通过作用于Leptin-AMPK通路、Leptin-Jak2-Stat3通路调节脂代谢,影响SREBP2、HMGCR、PPARα、LXRα、CYP7A1、NPC1L1、SR-BI、ABCG5、ABCG8等基因的表达,以抑制肝脏胆固醇合成、促进胆固醇分解,以及抑制小肠胆固醇吸收。胆汁酸是体内清除胆固醇的重要形式,对于维持胆固醇的稳态和防止胆固醇、甘油三酯和有毒代谢物的积累以及肝脏和其他器官的损伤是至关重要的。因此,为了进一步阐明黄连吴茱萸配伍的降脂机制,我们提出连萸配伍是否会影响这一重要过程。研究目的:以高脂血症模型小鼠为研究载体,以胆汁酸代谢为切入点,采用实时荧光定量PCR法、蛋白质免疫印迹法观察黄连吴茱萸配伍对胆汁酸代谢负反馈调节通路FXR/FGF15/FGFR4相关基因、蛋白表达的影响,用色谱-质谱分析法观察黄连吴茱萸配伍对胆汁酸代谢谱的影响,探讨黄连吴茱萸调控胆汁酸代谢发挥降脂效应的作用机制。研究方法:1.动物分组及给药48只雄性C57BL/6小鼠,普通饲料适应性喂养3天,称小鼠体重并记录,禁食12h,每只小鼠尾静脉取血约0.5ml,3500r/min离心15min分离血清,检测各组小鼠血清总胆固醇含量。根据测得血清总胆固醇值及小鼠体重,将小鼠随机分为6组,空白组(n=8)、模型组(n=8)、阿托伐他汀组(n=8)、连萸低剂量组(n=8)、连萸中剂量组(n=8)、连萸高剂量组(n=8),使组间初始总胆固醇值及体重值无差异。空白组小鼠给予普通饲料饲养,其余各组小鼠给予高脂饲料饲养,实验过程中所有动物自由采食和饮水。制备好中药煎剂,每日根据各组动物体重给予相应药物灌胃,给药体积为1ml/100g,空白组和模型组大鼠均给予生理盐水灌胃,给药频率为1次/天,连续灌胃给药8周。2.血清脂质水平及炎性因子水平的检测采用酶化学法测定血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、白介素6、白介素10、肿瘤坏死因子α的含量,观察黄连吴茱萸配伍对高脂血症模型小鼠血清脂质水平及炎性因子水平的影响。3.肝脏病理形态观察采用HE染色镜下观察黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠肝脏病理形态的影响。4.FXR/FGF15/FGFR4通路相关基因表达的检测采用实时荧光定量PCR法检测黄连吴茱萸配伍对FXR、FGF15、FGFR4、CYP7A1基因表达水平的影响。5.FXR/FGF15/FGFR4通路相关蛋白表达的检测蛋白质免疫印迹法检测黄连吴茱萸配伍对FXR、FGF15、FGFR4、CYP7A1蛋白表达水平的影响。6.粪便胆汁酸代谢谱的检测采用色谱-质谱法观察黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠粪便胆汁酸代谢谱的影响。研究结果:1.黄连吴茱萸配伍对高脂血症模型小鼠血脂水平的影响相较于空白组,模型组小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、总胆固醇水平明显升高(P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇水平明显降低(P<0.01)。相较于模型组,连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组血清低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、总胆固醇水平明显降低,高密度脂蛋白胆固醇明显升高(P<0.05)。2.黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠肝脏指数及病理形态的影响相较于空白组,模型组小鼠肝脏指数明显升高(P<0.01);相较于模型组,连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠的肝脏指数明显降低(P<0.01)。相较于空白组,模型组小鼠肝脏出现脂肪变性,见脂肪空泡,并伴有炎性细胞浸润;相较于模型组,连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组可不同程度改善上述表现,其中连萸低、中、高剂量组优于阿托伐他汀组。3.黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠炎性因子水平的影响相较于空白组,模型组小鼠血清白介素6、肿瘤坏死因子α水平明显升高(P<0.01),白介素10水平明显降低(P<0.01)。相较于模型组,连萸低、中、高剂量组小鼠血清白介素6水平降低(P<0.05);连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠血清肿瘤坏死因子α水平明显降低(P<0.01);连萸低、中剂量组小鼠血清白介素10水平明显升高(P<0.01)。4.黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠FXR/FGF15/FGFR4通路靶基因的影响相较于空白组,模型组小鼠回肠FXR、回肠FGF15、肝脏FGFR4基因表达水平明显升高,肝脏CYP7A1、肝脏FXR基因表达水平明显降低(P<0.05)。相较于模型组,连萸低、中剂量组和阿托伐他汀组小鼠回肠FXR基因表达水平明显降低(P<0.05);连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠回肠FGF15基因表达水平明显降低(P<0.01);连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠肝脏FGFR4基因表达水平降低(P<0.01);连萸低、中、高剂量组小鼠肝脏CYP7A1基因表达水平明显升高(P<0.05);连萸中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠肝脏FXR基因表达水平明显升高(P<0.05)。5.黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠FXR/FGF15/FGFR4通路靶蛋白的影响相较于空白组,模型组小鼠回肠FXR、回肠FGF15、肝脏FGFR4蛋白表达水平明显升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05),肝脏CYP7A1、肝脏FXR蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。相较于模型组,连萸低、中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠回肠FXR、FGF15蛋白表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05);连萸低、中、高剂量组小鼠肝脏FGFR4蛋白表达水平明显降低(P<0.05);连萸低、高剂量组小鼠肝脏CYP7A1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);连萸低、中、高剂量组小鼠肝脏FXR蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。6.黄连吴茱萸配伍对高脂血症小鼠粪便胆汁酸代谢谱的影响(1)从胆汁酸的分类来看: 初级胆汁酸和次级胆汁酸:空白组小鼠初级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的42.39%,次级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的57.61%。模型组小鼠初级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的32.90%,次级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的67.10%。连萸中剂量组小鼠初级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的46.92%,次级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的53.08%。 游离胆汁酸和结合胆汁酸:空白组小鼠游离胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的97.39%,结合胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的2.61%。模型组小鼠游离胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的98.34%,结合胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的1.66%。连萸中剂量组小鼠初级胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的94.15%,结合胆汁酸占粪便总胆汁酸谱的5.85%。(2)从差异胆汁酸来看,相较于空白组,模型组小鼠粪便胆汁酸12-KLCA、GDCA、HDCA、Apo CA、CDCA、DCA、Iso LCA、LCA表达上调(p<0.05),TMCA、TUDCA、TCDCA、α-MCA表达下调(p<0.05)。相较于模型组,连萸中剂量组小鼠粪便胆汁酸7-KDCA、UDCA、CA、GCA上调(p<0.05),12-KLCA、Apo CA、Iso LCA下调(p<0.05)。结论:1.高脂血症的中医病机相对复杂,脾胃升降失常是其关键病机,治当辛开苦降,升清降浊。黄连、吴茱萸配伍作为辛开苦降法的代表,具有明显的调脂、抗炎作用。2.黄连、吴茱萸配伍通过抑制FXR/FGF15/FGFR4通路,上调CYP7A1的表达,促进胆汁酸的合成,影响胆汁酸代谢发挥调脂作用。