【摘 要】
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研究目的:课题组前期研究发现RFX3是中国汉族人群痛风易感基因,但其参与痛风炎症过程的机制不清。本研究拟构建单核细胞RFX3条件性敲除小鼠模型,并应用该小鼠模型及原代骨髓单核细胞研究RFX3对痛风发病过程中的炎症细胞及炎症因子的调控作用及机制。研究方法:1.基于同源重组原理,本研究采用受精卵同源重组的方式,对RFX3基因进行flox修饰,获得条件性敲除RFX3基因的flox小鼠;将该flox小鼠和
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研究目的:课题组前期研究发现RFX3是中国汉族人群痛风易感基因,但其参与痛风炎症过程的机制不清。本研究拟构建单核细胞RFX3条件性敲除小鼠模型,并应用该小鼠模型及原代骨髓单核细胞研究RFX3对痛风发病过程中的炎症细胞及炎症因子的调控作用及机制。研究方法:1.基于同源重组原理,本研究采用受精卵同源重组的方式,对RFX3基因进行flox修饰,获得条件性敲除RFX3基因的flox小鼠;将该flox小鼠和Lyz2-Cre工具鼠进行交配,获得选择性髓系单核细胞RFX3特异性敲除小鼠（KO小鼠）及其对照小鼠（WT小鼠）。剪尾法采集小鼠DNA,PCR法鉴定小鼠基因型;分离和培养小鼠骨髓单核细胞,利用L929细胞上清分化7天后采用免疫荧光染色及Western blot方法检测RFX3蛋白的表达水平。2.检测KO及对照小鼠血生化、血常规等指标,明确条件性敲除RFX3基因对小鼠表型的影响。3.构建MSU诱导的小鼠腹膜炎模型,4小时后采集小鼠腹腔灌洗液,分离灌洗液中细胞,Fc阻断剂封闭,加入ly6G抗体（FITC标记）、CD3抗体（Percp/cy5.5标记）、F4/80抗体（APC标记）、CD11b抗体（PE标记）及CD45抗体（PB标记）孵育,流式细胞术检测和分析单核/巨噬细胞（CD45+F4/80+CD11b+）、中性粒细胞（CD45+ly6G+CD11b+）、淋巴T细胞（CD45+CD3+）数量。收集腹腔灌洗液中细胞,提取RNA,q RT-PCR检测IL-1β,IL-6,TGF-β等炎症因子m RNA表达水平,并应用ELISA法检测灌洗液上清检测IL-1β分泌水平。4.分离培养小鼠骨髓单核细胞,L929细胞上清诱导为单核/巨噬细胞,流式细胞术检测细胞分化水平;细胞划痕及Transwell实验检测细胞迁移能力,明确RFX3对小鼠单核细胞功能的影响。5.鬼笔环肽染色观察RFX3对巨噬细胞细胞骨架的影响,蛋白组学研究探讨RFX3调控单核/巨噬细胞迁移能力及炎症水平的机制。研究结果:1.利用受精卵同源重组的方法,本研究成功构建RFX3基因条件性敲除小鼠。基因鉴定结果显示,KO小鼠表达出flox和Cre条带;Western blot和免疫荧光染色结果均显示,KO小鼠单核细胞RFX3蛋白表达水平明显降低。2.KO小鼠血生化与血常规指标与对照组相比均无明显差异。3.本研究成功构建了MSU诱导的小鼠腹膜炎模型,对该模型腹腔灌洗液中炎症细胞的流式细胞术检测与分析结果显示,RFX3敲除小鼠巨噬细胞数量较对照小鼠明显增加（P<0.05）,中性粒细胞和淋巴T细胞数量无明显变化;m RNA检测结果显示,KO小鼠腹腔灌洗液中炎症细胞IL-1β,IL-6及TGF-β表达水平与对照组无明显差异;ELISA检测结果显示,KO小鼠较WT小鼠腹腔灌洗液IL-1β表达水平明显降低。提示,RFX3可能参与对单核/巨噬细胞迁移的调节。4.对单核/巨噬细胞分化水平研究结果显示,RFX3敲除对骨髓单核细胞分化程度无明显影响;细胞划痕实验结果显示,RFX3基因敲除小鼠骨髓单核细胞迁移能力显著增加;细胞Transwell实验结果显示,RFX3基因敲除小鼠骨髓单核细胞迁移数量显著高于对照组（1052.27±56.88/cm3 vs.824.6±45.71/cm3）。该研究结果表明RFX3敲除促进了单核/巨噬细胞的迁移能力;5.细胞骨架染色结果显示,KO小鼠骨髓单核细胞黏着斑面积及足小体数量明显增加;蛋白组学研究结果显示,actin cytoskeleton通路与痛风密切相关。上述研究结果提示,RFX3敲除后引起单核/巨噬细胞骨架结构发生变化,可能是其迁移能力增强的重要机制。结论:本研究成功构建了单核细胞RFX3条件性敲除小鼠模型,且基因敲除对小鼠血常规及血生化表型无明显影响;RFX3基因敲除明显降低痛风炎症水平,改变单核/巨噬细胞骨架结构,促进单核/巨噬细胞迁移可能其调控痛风炎症的关键机制。
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