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肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)包括游离型TNF-α(sTNF-α)和跨膜型TNF-α(tmTNF-α)。tmTNF-α是sTNF-α的前体，以Ⅱ型膜蛋白的形式表达在活化的巨噬细胞、淋巴细胞或其他类型细胞的表面。通过TNF转化酶(TNF-α converting enzyme, TACE)剪切为sTNF-α,释放到胞外。TNF-α受体有两型：TNFR1(CD120a）和TNFR2（CD120b）。两型TNF-α均可通过TNFR介导多种生物学效应。其中sTNF-α可通过TNFR1的死亡结构域（DD)募集TRADD, FADD和caspase-8，形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signalling complex，DISC）导致细胞凋亡。 信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一类双功能分子，既可作为转录因子，与靶基因调控区DNA结合，激活基因转录；也可参与胞内信号传导，从而在调节细胞增殖、生存、凋亡和分化中起着重要作用。 本室前期工作发现，tmTNF-α可通过TNFR1募集死亡诱导信号复合体(DISC)介导细胞凋亡,不依赖于TNFR1的内化及其死亡结构域（DD)，且可通过TNFR1的非DD结构域在细胞膜上募集 STAT1，同时，STAT1与TNFR1及TRADD均可直接结合。推测，STAT1可能作为TNFR1募集TRADD的衔接分子，进而继续募集FADD和caspase-8介导细胞凋亡。本研究主要探讨STAT1是否参与tmTNF-α通过TNFR1介导细胞凋亡并研究其具体机制。其主要结果如下： 一．STAT1促进tmTNF-α通过TNFR1介导的细胞凋亡 使用缺陷STAT1的细胞U3A以及转染STAT1的U3A(U3A-STAT1)，tmTNF-α分别刺激48h,同时设立无血清对照组。以MTT检测tmTNF-α对两种靶细胞的杀伤作用，结果表明，tmTNF-α对两组靶细胞在均呈现杀伤效应，且转染STAT1后，这种杀伤效应明显升高。说明STAT1对tmTNF-α的杀伤有促进作用。同时使用免疫共沉淀法，检测tmTNF-α刺激30min后TNFR1能募集的凋亡信号分子，分组同上，结果表明：转染STAT1后，TNFR1能募集STAT1，同时募集的DISC信号分子增多，表明STAT1促进了tmTNF-α通过TNFR1诱导的细胞凋亡。 二．STAT1在tmTNF-α通过TNFR1诱导细胞凋亡的信号通路中可作为衔接分子发挥重要作用 本课题组前期工作提示，STAT1可能通过与TNFR1的非死亡结构域直接结合，作为衔接分子募集DISC复合物中的TRADD等分子，进而参与tmTNF-α通过TNFR1介导的细胞凋亡。为证明这一观点，我们分别用带his标签的空载，TNFR1及TNFR1-DD转染U3A细胞，tmTNF-α刺激30min后，使用His抗体进行免疫共沉淀，结果显示：在缺陷STAT1的细胞U3A中，野生型TNFR1能够募集DISC，而缺失死亡结构域的TNFR1-ΔDD则不能。该结果表明在缺乏DD时，STAT1在tmTNF-α诱导的细胞凋亡中可作为衔接分子发挥着重要的作用。 三．STAT1在tmTNF-α作用下被募集到细胞膜上，而在sTNF-α作用下跟随TNFR1内化至胞浆中 STAT1可作为信号转导的衔接分子，同时也是一种核转位分子。用两型TNF-α分别刺激转染STAT1的U3A细胞和高表达TNFR1的U937细胞，同时设立对照组和抗体封闭组。免疫荧光共聚焦结果表明，tmTNF-α作用后，STAT1未出现核转位现象，而sTNF-α作用于肿瘤细胞后，STAT1可向细胞膜内募集。为了更清楚的验证这个结论，两型TNF-α刺激后，我们分别提取胞浆胞膜和胞核蛋白。Western检测STAT1的分布。结果表明，sTNF-α刺激后，STAT1主要分布在胞浆中，而tmTNF-α刺激后，STAT1则主要分布在膜上。 四．STAT1参与tmTNF-α对肿瘤细胞的杀伤作用主要依赖于STAT1的727位丝氨酸的磷酸化 将针对STAT1两个磷酸化位点的三个体变体：STAT1-701Y、STAT1-727S及STAT1-DM（双位点突变）分别瞬时转染至U3A细胞，调整转染条件至其转染效率趋于一致后，进行细胞毒实验，结果发现，对照组杀伤率为23.25％，野生型的杀伤率为54.16％，转染STAT1-701Y组的杀伤率为42.15％，STAT1-727S组杀伤率为31.51％, STAT1-DM组为30.91％。双位点突变的质粒STAT1-DM与STAT1-727S组的杀伤作用几乎回复到对照水平，STAT-701Y组的杀伤作用相对减弱。表明STAT1作为衔接分子参与tmTNF-α信号通路，需要依赖其磷酸化，且主要依赖于727位丝氨酸氨基磷酸化。 同时将质粒STAT1-701Y、STAT1-727S瞬时转染至U3A细胞，tmTNF-α刺激30min，免疫共沉淀，检测TNFR1能募集的DISC分子。结果表明，STAT1-727S转染与未转染组相比，TNFR1所募集的TRADD、FADD这两个DISC分子的蛋白水平没有变化；STAT1-727S转染组与野生型STAT1转染组相比，TRADD、FADD募集量明显减少。STAT1对DISC信号分子的募集依赖其磷酸化。 综上所述，本研究证实STAT1可作为衔接分子，结合在TNFR1的非DD结构域，进而募集TRADD、FADD等下游信号分子，且这种介导凋亡作用主要依赖于STAT1的727位丝氨酸磷酸化。本研究阐明了STAT1参与tmTNF-α介导细胞凋亡的分子机制，为肿瘤治疗提供了新的靶点。