绒山羊胎儿成纤维细胞酵母双杂交文库构建并筛选4E-BP1相互作用蛋白

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真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(eukaryotictranslationinitiationfactor4E-bindingprotein1,4E-BP1)作为eIF4E的抑制蛋白,调节翻译起始和蛋白质合成。低磷酸化的4E-BP1与eIF4E有很高的亲和力,抑制eIF4E与mRNA5端的7甲基鸟苷酸帽子结构结合,进而抑制翻译起始,而磷酸化后的4E-BP1释放eIF4E,启动翻译。4E-BP1作为mTOR(themammaliantargetofrapamycin)信号通路的下游效应器,其磷酸化受到生长因子、营养、能量状态及细胞内环境胁迫的影响。FKBP38是FKBP(FK506-bindingprotein)家族的一员,可以结合mTORC1(mTORcomplex1)而抑制其活性,进而抑制4E-BP1的磷酸化。4E-BP1和FKBP38在蛋白质合成和细胞生长调控中发挥着重要的作用。内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat)是生活在内蒙古西部的荒漠和半荒漠草原地区的绒肉兼用型品种,在营养需求与代谢方面具有与其生存环境相适应的特殊性。研究内蒙古白绒山羊细胞内蛋白合成的起始机制可为动物个体发育过程中基因表达和调控研究提供良好的模式,对促进绒肉产量和品质形成具有重要意义。  本实验以内蒙古白绒山羊为材料,首先克隆4E-BP1基因并构建以4E-BP1为诱饵的表达质粒pGBKT7-4E-BP1;进而构建内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库;最后以诱饵质粒pGBKT7-4E-BP1、pGBKT7-FKBP38对内蒙古白绒山羊cDNA文库进行筛选,以寻找与4E-BP1、FKBP38相互作用蛋白,并对候选蛋白进行初步鉴定分析。通过对相互作用蛋白质的筛选及研究,为深入探讨4E-BP1、FKBP38的生物学功能及作用机制提供新思路。  结果表明:1)克隆得到内蒙古白绒山羊4E-BP1基因的CDS序列,基因全长357bp,编码118氨基酸残基;2)将克隆的4E-BP1基因亚克隆到pGBKT7载体,构建pGBKT7-4E-BP1酵母双杂交诱饵载体,经酶切及测序鉴定正确;3)以GAL4系统构建内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞cDNA文库,文库滴度指标为3.29×107cfu/ml。4)将pGBKT7-4E-BP1诱饵质粒转化Y2H酵母菌株,检测pGBKT7-4E-BP1表达的融合蛋白对酵母菌株无毒性和自激活作用,证明pGBKT7-4E-BP可用于筛选文库;5)利用pGBKT7-4E-BP1诱饵质粒筛选内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞cDNA文库,经过SD/-Leu/-Trp/-His、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/ba、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade四轮筛选,得到了3个阳性克隆,pGADT7-未知基因质粒经过测序及生物信息学分析确定含有编码淋巴细胞特异性解旋酶(helicase,lymphoid-specific,transcriptvariant2,HELLS)、胶原蛋白(collagen,typeI,alpha2)和PDLIM7(PDZandLIMdomain7)编码基因;利用pGBKT7-FKBP38诱饵质粒筛选内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞cDNA文库,经过SD/-Leu/-Trp/-His、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/Aba、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade四轮筛选,得到了1个阳性克隆,pGADT7-未知基因质粒经过测序及生物信息学分析确定为核糖体蛋白S15(RibosomalproteinS15)编码基因。  本文应用酵母双杂交技术,以4E-BP1和FKBP38为诱饵蛋白筛选绒山羊胎儿成纤维细胞eDNA文库,得到3个与4E-BP1相互作用蛋白和1个与FKBP38相互作用蛋白。实验结果丰富了4E-BP1、FKBP38在绒山羊细胞内的结合靶,为阐明4E-BP1、FKBP38在蛋白质合成和细胞生长调控的作用与机制提供了科学数据。4E-BP1与筛选出的靶蛋白淋巴细胞特异性解旋酶(helicase,lymphoid-specific,transcriptvariant2,HELLS)、胶原蛋白(collagen,typeⅠ,alpha2)和PDLIM7(PDZandLIMdomain7),FKBP38与筛选出的靶蛋白核糖体蛋白S15(RibosomalproteinS15)结合的生物学意义还有待于进一步的实验证明。
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