目的：　　乳腺癌是女性一种常见的恶性肿瘤，已成为女性肿瘤患者死亡的主要原因。乳腺癌的发生经历了以下几个阶段：正常导管上皮→普通型导管上皮增生→不典型导管上皮增生→导管原位癌→浸润性导管癌，探讨与乳腺癌动态发展过程相关基因的改变对治疗乳腺癌具有重要意义。　　SIAH2(Seven-In-Absentia Homolog2)蛋白具有E3泛素连接酶的活性，可调节一些蛋白的泛素化和降解，这些蛋白包括DCC，Bag-1，TRAF2，PHD1/3，Spry2等。近来发现SIAH2可作为一种重要的肿瘤因子发挥生物学作用，SIAH2在有增殖能力的细胞中表达（正常和瘤细胞），如宫颈癌细胞，乳腺癌细胞，人胚肾细胞及结直肠腺瘤组织等，而在不增殖的细胞中表达缺失。研究报导抑制SIAH2的功能后能够阻断ERK信号通路，抑制软琼脂中胰腺癌细胞的自主生长和裸鼠体内胰腺肿瘤的形成，最近研究发现SIAH2在几乎所有类型肺癌组织中均有表达，并且随着肺癌分化程度的降低SIAH2的表达显著增加，而在正常肺组织中几乎不表达。促凋亡蛋白BAD(Bcl-xl/Bcl-2-Associated Death Promoter)属BCL-2家族成员，是BCL-2/BAX、BCL-XL/BAX异二聚体的负调节蛋白。BAD促凋亡作用的发挥可能是通过与BCL-2家族中的凋亡抑制蛋白BCL-2和BCL-XL的表达产物形成异源二聚体，进而逆转其抑制凋亡的作用而达到促凋亡效果。另一方面，与BCL-2相比，BAD与BCL-XL的结合更强，BAD以浓度依赖性方式替换BCL-XL/BAX、BCL-2/BAX异二聚体中的BAX，使BAX游离后形成同源二聚体从而使Cyt-c和其他凋亡基因释放诱导细胞死亡。研究表明BAD蛋白在许多人类正常组织中有表达，其中在乳腺组织中与其他组织相比BAD表达水平相对较高。　　研究发现ERK可通过激活RSK磷酸化促凋亡分子BAD的Ser112，从而上调BCL-2，BCL-XL等蛋白而产生抗凋亡作用。Siah2可能通过P-ERK途径来调节细胞凋亡，那么，Siah2是否可通过P-ERK来调控BAD，从而抑制细胞凋亡呢？　　本研究主要探讨SIAH2调控乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的机制。应用转染了SIAH2表达质粒和SIAH2siRNA的乳腺癌细胞来观察SIAH2表达增加或表达缺失对ERK信号通路的影响。并应用Spry2siRNA和ERK的特异性抑制剂来分析P-ERK在乳腺癌细胞凋亡、增殖和侵袭中的作用。　　材料与方法：　　1、材料　　200例乳腺组织标本均来自沈阳医学院奉天医院2006年至2009年肿瘤外科手术切除的标本，所有患者术前均未接受放、化疗。且所有标本的使用均征得了患者本人同意，签订知情同意书。标本经4％中性甲醛固定，石蜡包埋，HE常规染色后明确诊断。其中部分癌组织和正常乳腺组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。　　2株乳腺癌癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7)，1株人乳腺正常上皮细胞系(MCF-10A)。用含10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％CO2的条件下培养。　　2、主要试剂和来源　　SIAH2鼠单克隆抗体，SIAH2siRNA，鼠单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。SP免疫组化试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。　　3、方法　　(1)免疫组织化学染色及结果判定　　标本固定，石蜡包埋，制成4μm连续切片，采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测SIAH2和Bcl-2蛋白表达。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。　　结果：判定：SIAH2以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色，Bcl-2以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(×400)下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数，根据免疫组化染色强度分为三个等级：浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。按SIAH2和Bcl-2表达百分率分为以下四个等级：0％为0分，1％-50％为1分，51％-75％为2分，＞75％为3分。以染色强度和阳性细胞率的分值乘积作为每一例的积分，积分＜4者判定为阴性，积分≥4为阳性。　　(2)Western Blot　　在收集的细胞内加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，15000转/min，30min)，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60μg。电泳（12％SDS-PAGE凝胶）、转印至PVDF膜、封闭，一抗SIAH2(1∶200)、Bcl-2(1∶200)和β-actin(1∶200)，4℃孵育过夜，分别与各自对应的二抗(1∶4000)室温孵育2小时，ECL显色，结果经自动凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定，β-actin做内参。　　(3)siRNA干扰和细胞转染　　SIAH2siRNA和control siRNA均购自santa cruz公司，转染试剂为HiperFect（Qiagen公司），具体步骤按试剂说明书进行。实验分三组：空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组。SIAH2表达质粒pcDNA3.1-flag-SIAH2和对照质粒pcDNA3.1-flag由Zeev Ronai（Burnham Institute，La Jol1a，CA，USA）教授惠赠，转染试剂为Attractene（Qiagen公司），具体转染步骤按试剂说明书进行。以未转染的细胞和转染空载体细胞作为对照。每个实验均重复三次。　　(4)MTT法检测细胞增殖和体外基质胶侵袭实验(Transwell小室法)　　处于对数生长期的乳腺癌细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，计数1×104/ml接种于96孔板培养板，培养48小时加入MTT(5mg/ml)20μl，继续孵育4小时后，每孔加入150μl DMSO溶解结晶，选择波长490nm，在酶联免疫(ELISA)检测仪上测定各孔吸光度。实验重复3次。　　用Matrigel基质胶和8μm孔径的Transwell小室(Costar，美国)检测细胞的侵袭能力。先用预冷无血清DMEM培养基以1∶7稀释Matrigel基质胶(BD Bioscienees)，美国，吸取100μl稀释的Matrigel基质胶加入上室，下室加入含10％小牛血清的培养基600μl。调至细胞密度为2.5×105个/ml，取100μl加入上室中。培养48小时后，吸尽培养基，甲醇固定，擦掉微孔膜上表面的细胞，苏木素进行细胞核染色。显微镜下计数侵袭至滤膜下表面的细胞数，每张滤膜随机计数10个视野(×400)，取平均值。实验重复3次。数据用均数±标准差(mean±SD)表示。　　(5)流式细胞仪检测细胞凋亡　　取对数生长期的细胞，以1×104/mL的密度接种于细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。培养24小时后，换无血清的DMEM培养液同步化24小时。加入处理因素，置37℃、5％CO2孵箱中常规培养48h后，分别制成单细胞悬液，加AnnexinⅤ/FITC室温避光10min，冲洗、离心、重悬细胞，加入20μg/ml PI，4℃避光30min。空白对照组只加入含10％血清的DMEM培养液作用。每组设3个样本。分析软件计算细胞凋亡率。　　4、统计分析　　各组资料应用SPSS13.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　1、SIAH2蛋白在乳腺癌组织和细胞系中高表达　　2、在浸润性乳腺癌中，SIAH2的表达与癌细胞的核分级、基因分型、P53及Ki67的表达相关　　3、乳腺癌细胞系中，过表达SIAH2可促进乳腺癌细胞的生长和侵袭，SIAH2通过P-ERK/P-BAD(S112)促进细胞的增殖，部分通过ERK通路促进乳腺癌细胞的侵袭　　4、在乳腺癌细胞系MCF-7中，抑制SIAH2的表达增加了乳腺癌细胞的凋亡;在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，抑制SIAH2的表达细胞凋亡无明显变化　　5、SIAH2在基底细胞样乳腺癌和管腔样乳腺癌中调控细胞凋亡的机制不同　　结论：　　1、SIAH2在乳腺癌癌变过程中可作为一种癌基因发挥作用，SIAH2的表达在乳腺癌的癌变过程中起重要作用。　　2、在乳腺癌细胞系中，过表达SIAH2能够促进乳腺癌细胞的增殖侵袭，干扰SIAH2表达抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭。SIAH2通过P-ERK/P-BAD(S112)促进细胞的增殖，部分通过ERK通路促进乳腺癌细胞的侵袭　　3、SIAH2在基底细胞样乳腺癌和管腔样乳腺癌中调控细胞凋亡的机制不同。