宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，我国每年新发病数超过13万。宫颈癌的传统治疗方法如手术、放疗和化疗对早期患者有一定的疗效，对中晚期宫颈癌的治疗则尚无良策，这促使人们一直在探索新的治疗方法。以树突状细胞为代表的抗原特异性肿瘤免疫治疗法是目前肿瘤临床治疗中的一种新尝试。本课题以宫颈癌的治疗为中心，开展了HPV16 E6E7抗原致敏的树突状细胞疫苗的研制及部分临床前检测工作。此外，为寻求治疗宫颈癌的新策略新方法，本研究还探索了microRNA-124在宫颈癌细胞中的抑癌效果。　　HPV是宫颈癌的主要致病因子，约99.7％的宫颈癌发病都与高危型HPV感染有关，其中约50％的宫颈癌与HPV16感染相关。高危型HPV的E6和E7蛋白是其主要致癌蛋白，在正常组织中不存在，只表达于HPV感染组织中，因此E6和E7蛋白是制备宫颈癌治疗性疫苗的理想靶抗原。本研究选择了HPV16 E6和E7的融合蛋白作为靶抗原致敏树突状细胞制备宫颈癌治疗性细胞疫苗。HPV16采用哺乳动物中的稀有密码子来降低病毒蛋白在宿主细胞中的表达，从而有利于病毒逃避人体免疫监视应答。为提高抗原蛋白的表达量和抗原致敏的效果，本研究在制备HPV16相关的宫颈癌疫苗时，采用了经过密码子优化的E6E7融合基因。此外，由于HPV16 E6和E7基因是癌基因，为进一步提高疫苗的安全性，本研究还采用了引入去致瘤性突变的E6E7优化融合基因，希望在保留其抗原性的基础上提高疫苗的安全性。　　树突状细胞被认为是功能最强大的抗原递呈细胞，是诱导产生杀伤肿瘤细胞抗原特异性T细胞反应的关键，本研究采用HPV16 E6E7致敏的树突状细胞作为宫颈癌治疗性疫苗。肿瘤细胞特异性抗原的致敏是树突状细胞疫苗制备中的一个关键步骤，相比核酸的脂质体转染、电穿孔和蛋白/多肽简单孵育法，重组腺病毒能更有效的将特异性抗原投递到树突状细胞中。本研究采用重组腺病毒感染的方式制备HPV16 E6E7致敏的树突状细胞疫苗。利用分子克隆技术和AdMax重组腺病毒包装系统成功构建了表达HPV16 E6E7融合蛋白的复制缺陷型的5型重组腺病毒，并在DNA水平和蛋白表达水平对其进行重组鉴定和复制缺陷型鉴定。通过氯化铯不连续密度梯度离心和超滤管离心的方式纯化大量扩增的重组腺病毒，并对重组腺病毒进行了滴度测定。　　本研究从小鼠后腿骨分离骨髓细胞诱导得到树突状细胞，并采用流式细胞术对树突状细胞进行了表面标志物鉴定。不同实验体系中，重组腺病毒感染树突状细胞的最优MOI值需要独立摸索。本研究通过荧光显微镜观测rAd-GFP感染树突状细胞产生的绿色荧光和Western blot检测rAd-E6E7-1感染后目的蛋白E6E7的表达，比较不同MOI感染条件下目的基因的表达效果。研究显示，本研究体系中MOI=500是重组腺病毒感染小鼠骨髓来源树突状细胞的理想条件。　　本研究采用表达野生型和去致瘤性突变型E6E7蛋白的重组腺病毒感染树突状细胞，分别得到树突状细胞疫苗DC-E6E7-1(野生型E6E7蛋白致敏的DC)和DC-E6E7-3(去致瘤性突变型E6E7蛋白致敏的DC)。疫苗免疫小鼠后，ELISPOT检测结果显示相比对照组两种树突状细胞疫苗均可诱导小鼠淋巴细胞激活并分泌IFN-γ，提示疫苗在小鼠体内诱导了抗肿瘤保护所需的Thl型免疫反应。此外，两种树突状细胞疫苗均可诱导小鼠产生宫颈癌抗原特异性的CTL杀伤反应，在体外可有效杀伤宫颈癌模拟细胞系TC-1，在小鼠体内可诱导产生良好的抗肿瘤免疫保护，能有效抵御TC-1肿瘤细胞的攻击。DC-E6E7-3疫苗在C56BL/6小鼠模型中的抗肿瘤活性较DC-E6E7-1有所降低。　　本研究还制备了人PBMC来源的树突状细胞，并用去致瘤性突变型HPV16E6E7-3重组腺病毒致敏该树突状细胞，得到人用宫颈癌细胞疫苗。委托有临床新药安全性评估资质的北京昭衍新药研究中心对该疫苗进行了急性毒性、溶血性和局部刺激性评估，发现该疫苗在临床拟用剂量的7500倍的急性毒性实验中未见毒性，在大鼠模型的溶血性和局部刺激性实验中未见毒性。本研究采用软琼脂集落形成实验和裸鼠接种实验发现该树突状细胞疫苗没有体内外致瘤活性。　　MicroRNA是一类具有基因转录后调控作用的内源性小分子RNA，参与生理和病理过程的调节。近年来大量的研究显示肿瘤具有特异的microRNA表达谱，许多microRNAs具有抑癌或促癌的功能，在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。　　MiR-124是一种在宫颈癌细胞中被甲基化沉默的microRNA，提示它可能具有抑癌活性。为研究miR-124在宫颈癌中的功能，本研究构建了表达miR-124的重组表达质粒，将该重组表达质粒转染到宫颈癌SiHa细胞后筛选稳定转染细胞株。通过GFP的表达和Real-time PCR检测稳定转染细胞株中miR-124的过表达。研究发现miR-124的过表达对SiHa的致瘤性无显著影响，但可导致SiHa细胞增殖能力下降。此外伤口愈合实验和Transwell细胞迁移实验显示细胞的迁移能力可被miR-124抑制，这可能与一些迁移相关的基因表达下调有关，但具体的分子机制目前尚不明确，还需要进一步的实验研究。探索miR-124和其他有抑癌功能的microRNA作为潜在的抗宫颈癌药物的研究还处在起步阶段，还需要大量深入的实验摸索和临床检验。