[目的]外泌体是多囊体（MVBS）与细胞质膜融合后释放的胞外小泡,它们起源于MVB形成过程中的腔内囊泡（ILVS）。外泌体被证明含有功能蛋白、脂质和RNA,介导细胞与细胞之间的通讯,从而在健康和疾病的有机体的生理学中发挥作用。据报道,登革病毒在感染过程中具有多种细胞功能,如外泌体介导的细胞通讯,这种功能是通过将携带病毒或抗病毒成分的胞外载体传递给宿主细胞来调节的。因此,研究外泌体在病毒感染中的特性和作用,将有助于了解其在病毒-宿主相互博弈中的作用,为抗病毒治疗提供新的靶点。[方法]对目前外泌体的分离和纯化方法进行评估,包括超速离心法、试剂盒法、超滤浓缩结合试剂盒法、碘克沙醇密度梯度离心法和免疫磁珠亲和法,并通过透射电镜、蛋白免疫印迹（Western blot）、纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定外泌体表征,比较提取的外泌体质量;将Ⅲ型登革病毒（DENV-3）感染人单核细胞（THP-1）细胞,通过NTA和Western blot检测病毒感染后外泌体释放量变化,利用RT-PCR、Western bolt、间接免疫荧光、实时荧光定量PCR等技术分析DENV-3感染THP-1宿主细胞释放的外泌体的特性及作用,验证其是否能包裹病毒核酸和蛋白在BHK-21和C6/36细胞上建立增殖性感染,逃避中和抗体的影响,使用GW4869外泌体抑制剂抑制细胞分泌外泌体后,检测细胞上清病毒拷贝数变化,分析外泌体在病毒感染中的作用;通过高通量测序对DENV-3感染THP-1后其上清外泌体miRNA的表达谱进行分析,筛选出差异表达的miRNA,利用实时荧光定量PCR方法对显著差异表达的miRNA进行验证。[结果]三种方法均能提取到外泌体,电镜下可观察到直径为30-150 nm,具有圆盘状和杯状结构的圆形或椭圆形囊泡,与试剂盒法和超滤浓缩结合试剂盒相比,超速离心法提取的外泌体背景清晰,杂质较少。Western blot均能检测到外泌体标志蛋白Alix、CD63和CD81的表达。NTA检测发现三种方法提取的外泌体粒径分布无明显差异,均为单一峰值。超滤结合试剂盒法与超速离心法相比,提取的外泌体浓度和总蛋白量较高,且操作步骤简捷,耗时较少;DENV感染会引起宿主细胞外泌体释放量增加,进一步研究发现,DENV-3病毒核酸和病毒E蛋白存在于外泌体中,同时,DENV-3感染THP-1细胞释放的外泌体可以介导C6/36细胞和BHK-21细胞感染,逃避中和抗体的影响。随后,使用外泌体抑制剂GW4869抑制细胞外泌体释放后,发现细胞上清中DENV病毒载量也随之降低,表明外泌体可能参与了 DENV的传播过程;通过高通量测序技术对登革病毒主细胞释放的外泌体中差异性miRNA做进一步筛选和鉴定,发现107种miRNA明显富集,其中,有96种miRNA在病毒感染细胞释放的外泌体中表达上调,11种表达下调。随后,利用对差异miRNAs的靶基因进行GO及KEGG富集分析,显示这些miRNA的靶基因主要富集于宿主免疫/炎症反应相关信号传导通路中,包括 Pathways in cancer、Ras signaling pathway、Rap1 signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等信号通路,利用实时荧光定量PCR方法对显著差异表达的6个miRNA进行验证,与测序结果一致,它们可能在登革病毒感染过程中起作用。[结论]超高速离心法、试剂盒法、超滤结合试剂盒法均能从细胞上清中提取到外泌体,碘克沙醇密度梯度离心法和免疫磁珠法可以将外泌体从DENV感染细胞上清中纯化出来而无病毒粒子的污染;携带登革病毒组分的外泌体可以进入靶细胞进建立有效感染,外泌体抑制剂GW4869的加入可抑制登革病毒在细胞中的传播;DENV感染改变了 THP-1细胞分泌的外泌体中宿主miRNA的种类和含量。