嗜热酶和超嗜热酶既具有较高的热稳定性，也具有较好的抗有机溶剂及变性剂的能力，因此在生物化工等领域开辟了新的应用前景。超嗜热古细菌AeropyrumpernixK1是目前为止发现的第一个超嗜热严格需氧古细菌，对来源于该古细菌的超嗜热酶进行研究，不但能够加深了解酶的稳定性和催化理论，而且对超嗜热酶的应用和蛋白质分子设计具有重要的意义。本论文研究内容主要分为两个部分： 1.超嗜热磷脂酶A2/酯酶的酶学性质研究 通过生物信息学方法分析，选择了嗜热古细菌AeropyrumpernixK1中的磷脂酶A2基因(APE2325)作为研究对象。采用PCR方法从古细菌的基因组中克隆出APE2325基因，将其插入到pET15b表达质粒中，构建工程菌。然后采用热处理和镍亲和柱层析的方法对其进行纯化。经SDS-PAGE电泳确定，其分子量为18KDa左右。通过对纯化的重组酶APE2325进行酶学性质研究结果表明：该酶既具有磷脂酶A2活力又具有酯酶活力。二者发挥催化活力的最适温度均为90℃。APE2325发挥酯酶作用的最适底物是对硝基苯酚丙酸酯。同时，该酶具有较强的耐碱性和较高的热稳定性。通过氨基酸组成分析，该酶含有大量的疏水氨基酸及带电荷的氨基酸，说明其热稳定性可能主要由疏水键和离子键决定的。通过对硝基苯酚丙酸酯底物的动力学研究表明，90℃时的Km，kcat，Vm分别为103.3μM，39.04s-1，249.69μmol/min·mg。另外，Ca2+对磷脂酶A2活力没有明显的激活作用，所以该酶属于钙不依赖型磷脂酶A2。目前为止，这是首次从超嗜热古细菌中成功克隆并表达磷脂酶A2基因，关于该酶晶体的培养工作正在进行中。 2.超嗜热酯酶APE1547稳定性机制的研究 以来源于超嗜热古细菌AeropyrumpernixK1的超嗜热酯酶APE1547作为研究对象，该酶经过晶体解析后，发现由两个结构域组成，即N端的β推进器结构域和C端的α/β水解酶结构域。这两个结构域之间除了以大量非共价键作用之外，N末端还具有1个α螺旋手臂结构与C端结构域相作用，因此推测该手臂结构对酶结构的稳定性以及活力调解具有重要的作用。采用基因工程手段切去手臂结构，对突变体重新表达。采用了热处理和柱层析相结合的方法进行纯化，并对野生型及突变体的酶学性质进行了比较，发现突变体的最适温度由野生型的90℃降低到75℃，金属离子及表面活性剂对二者的作用也有部分差别，但是底物特异性并未发生改变。 为了进一步探询手臂结构对酯酶稳定性的影响机制，采用了活力测定与构象检测相结合的方法，研究了在变性因素(温度、脲、盐酸胍)作用下酶的催化作用与结构变化之间的关系。发现突变体的热稳定性明显低于野生型，0.05mg/ml的野生型酶在80℃的半衰期为11.22小时，而突变体仅为0.83小时。另外，盐酸胍和脲对两种酯酶的影响也有很大差异，3M的盐酸胍使野生型的活力完全消失，6M盐酸胍处理经复性后，野生型仍能恢复20％的活力；而1M盐酸胍就会使突变体活力完全消失，并且3M盐酸胍处理后的突变体完全不能恢复活性。脲对突变体的失活效果也要强于野生型。内源荧光检测表明，在相同的变性剂浓度下，突变体的活力损失及三级结构的变化都要快于野生型。上述结果说明，超嗜热酯酶 APE1547的N—末端手臂结构缺失后，不仅N端结构域与C端结构域之间的连接作用被破坏，而且导致了两个结构域的结构也相对松散，其热稳定性和抗变性剂的能力明显降低。 手臂结构对酶分子稳定性作用机制的研究为酶的分子改造提供了理论依据。