目的：寻找更佳的关节软骨玻璃化保存程序，并将玻璃化法与其他冷冻方法(慢速梯度降温法、直接液氮冷冻法)比较，探讨玻璃化法保存关节软骨的可行性和优越性。 方法： 实验1.骨软骨移植物在玻璃化液中浸泡时间的筛选：以猪为研究对象，无菌条件下在内外侧股骨髁关节面负重区切取圆柱性骨软骨块，其直径约为4.5mm，骨及所带软骨下骨全长约5mm，共32枚，随机分为四组，每组8枚：新鲜组(Ⅰ组)为对照组，其余各组在412经梯度玻璃化溶液：1/3浓度VS1→2/3浓度VS1→VS1(VS1为含20.5％二甲基亚砜、15.5％乙酰胺、10％1,2-丙二醇、6％聚乙二醇(8000)的玻璃化溶液)逐级浸泡,总时间分别为30min(Ⅱ组)、60min(Ⅲ组)、90min(Ⅳ组)，然后以最快速度直接投入液氮中保存2周，复温后用荧光染色检测细胞存活率，以选择较合适的浸泡时间。 实验2.采用实验1筛选的玻璃化法与慢速梯度降温法、直接液氮冷冻法的比较研究：取材同实验1，共取骨软骨块120枚，随机分为新鲜对照组(A组)18枚、玻璃化组(B组)34枚、慢速梯度降温组(C组)34枚、直接液氮冷冻组(D组)34枚。慢速梯度降温组将标本在4℃ 10％DSMO浸泡30min，然后在程序冷冻仪中以-1℃/min的速率降温至-4℃维持45min、-8℃维持30min、-40℃维持10min，最后放入-80℃保存。直接液氮冷冻组不经预处理直接将标本投入液氮中保存。各实验组在2周、8周时间点分别取8枚进行组织学、组织化学(番红O染色显示软骨基质蛋白多糖PG的变化)检测，8枚进行细胞存活率(荧光染色法)检测，在2周点取2枚行软骨纵断面扫描电镜(SEM)检查，了解软骨基质的损伤情况，新鲜组在取材半小时内检测指标。 结果： 实验1.各组的软骨细胞存活率依次为：Ⅰ组96.60％、Ⅱ组75.24％、Ⅲ组64.22％、Ⅳ组51.58％。各实验组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)均下降，各组间两两比较差异均有显著统计学意义，Ⅱ组即30分钟组软骨细胞存活率明显高于其余两实验组，证实30分钟是较合适的浸泡时间。 实验2.①PG的变化：C组即慢速梯度降温组PG(IOD值)减少明显，2周点与对照组比较有统计学意义，8周点与对照组比较有显著统计学意义；其它两组PG下降不明显，在2周和8周点与对照组比较均无统计学意义。②软骨细胞存活率：随保存时间延长各实验组均程度不同下降，B组(玻璃化组)2周75.24％，8周62.33％：C组(慢速梯度降温组)2周56.15％，8周37.78％：D组(直接液氮冷冻组)存活率极低，2周和8周均不到5％。B组与C组比较，在2周和8周点差异均有显著统计学意义。证实玻璃化法比慢速梯度降温法能获得更高的软骨细胞存活率。③SEM检查：软骨基质的损伤程度：直接液氮冷冻组>慢速梯度降温组>玻璃化组。 结论： 1.软骨冷冻损伤客观存在不可完全避免，但可被减弱。通过软骨冷冻保存方法的改进，可以提高冷冻保存后软骨细胞存活率，减少软骨基质的损伤。 2.与慢速梯度降温法相比，玻璃化法能显著提高冷冻保存后软骨细胞存活率，能更好地维持软骨基质中PG的稳定，对基质的损伤更小。用玻璃化法体外冷冻保存关节软骨效果理想。但是，移植效果需进一步体内实验验证。 3.直接液氮冷冻法软骨细胞存活率极低，对基质损伤严重。