第一大部分：miR17在蛋白酶体抑制剂ps341抗肿瘤过程中的作用　　背景：　　泛素化蛋白酶体系统（ubiquitin-dependent proteolysis system, UPS）是细胞内蛋白降解的最主要系统，因而其在细胞生长、增殖、凋亡、蛋白数量控制、DNA修复、转录和免疫反应等方面都有重要作用。从肿瘤组织细胞中具有较高UPS活性为起点，蛋白酶体抑制剂（Proteasome inhibitor,PI）抗肿瘤的研究和临床应用取得了很好的效果。PI在多发性骨髓瘤、淋巴瘤等临床的应用已经较为成熟，也为难治患者或复发患者提供了好的选择，但是PI的毒性大、易耐药、易复发、实体瘤效果不佳等问题一直限制着蛋白酶体抑制剂的使用。　　微RNA（miRNA）是一类新的非蛋白质编码的内源性小RNA。它们在动植物细胞内发挥着重要的调节作用，人类基因组中有4％与编码miRNA有关。通过与靶蛋白RNA互补结合，切割或降解靶蛋白RNA。研究表明，一些miRNA的调控细胞增殖和凋亡的过程是在癌症的形成非常重要。通过使用多个分子技术，其中包括Northern印迹分析，实时PCR，miRNA芯片，上调或下调表达特定miRNA的，人们发现，几种miRNA的直接参与人类癌症，包括肺癌，乳腺癌，脑癌，肝，结肠直肠癌和白血病。此外，一些微RNA可以用作癌基因或肿瘤抑制基因。50％以上miRNA基因的分布在癌症相关的基因组区域，这表明可能的miRNAs在肿瘤发生发展着有着关键作用。miRNAs可能作为原癌基因和抑癌基因调节肿瘤细胞的发展。miRNAs在肿瘤组织或细胞中的表达谱可能成为今后癌症诊断分级分期的重要标志物。因此，利用miRNA作用机制治疗肿瘤前景广阔。探讨PI抑制剂作用于肿瘤细胞之后miRNAs表达谱的变化有着重要意义。很可能为解决PI目前临床应用所遇到的困难提供很好的思路。　　第一部分：蛋白酶体抑制剂作用下的miR-17表达　　目的：　　研究在蛋白酶体抑制剂的作用下对肿瘤细胞miR-17的影响。　　方法：　　通过比较ps341和ps341+miR17处理Hep G2细胞、SMMC7721细胞、U266细胞和H929细胞后，使用q-RTPCR检测作用后3h、6h、9h和12h后miR17的表达量的变化来确定蛋白酶体抑制剂ps341作用肿瘤细胞后miR17的变化。　　结果：　　研究发现Ps341处理HepG2细胞、SMMC7721细胞、U266细胞和H929细胞均能使miR-17表达明显减少。Ps341处理HepG2细胞后12h后miR-17表达明显减少，而SMMC7721细胞、U266细胞和H929细胞均在ps341处理9h后既有明显下降。　　结论：　　ps341能够导致Hep G2细胞、SMMC7721细胞、U266细胞和H929细胞内miR17减少。　　第二部分：miR-17在蛋白酶体抑制剂ps341抗肿瘤过程中细胞效应机制　　目的：　　研究ps341与miR-17共同对肿瘤细胞的作用。　　方法：　　使用MTS法研究miR175p和ps341对Hep G2细胞、SMMC7721细胞、U266细胞和H929细胞活性的影响。使用免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜研究miR175p和ps341对Hep G2细胞凋亡的影响。使用western blotting研究miR175p和ps341对Hep G2细胞凋亡相关蛋白的影响。　　结果：　　1、肝癌细胞Hep G2的miR175p组、neg+ps341组和miR175p+ps341组均能导致细胞活性下降。miR175p组和 neg+ps341组之间没有统计学差异，然而miR175p+ps341组细胞活性下降明显，与其他三组相比，P＜0.05,具有统计学差异。肝癌细胞SMMC7721的miR175p组细胞活性没有明显下降，neg+ps341组细胞活性与neg组、miR175p组相比较，P＜0.05，具有统计学差异，miR175p+ps341组与其他三组相比，细胞活性下降，P＜0.05,具有统计学差异。人髓外B淋巴瘤U266细胞四组之间均有统计学差异，P＜0.05。人骨髓B淋巴瘤H929细胞，miR175p组与对照相比细胞活性没有明显下降，neg+ps341组和miR175p+ps341组均能导致细胞活性下降，但两组之间比较未发现统计学差异。对于 miR175p-I，各细胞各处理组均表现出相同规律，即neg+ps341组和miR175p-I+ps341组均能降低细胞活力，但组间没有统计学差异，而miR175P-I组不能使细胞活力明显下降。　　2、miR17组以凋亡为主而neg+ps341组和miR17+ps341组可导致Hep G2细胞发生晚期凋亡和坏死。　　3、可见miR17-I+ps341组、miR17+ps341组Procaspase-3条带光密度值均减弱，其他各组差异不明显；miR17组Procaspase-8明显减少；Procaspase-9在miR17组、neg+ps341组、miR17-I+ps341组和miR17+ps341组中均有明显减少；miR17组有明显PARP裂解条带，miR17+ps341组更明显；miR17+ps341组FOXO3α的表达明显下降。　　结论：　　1、miR175p联合使用ps341可以导致Hep G2细胞、SMMC7721细胞、U266细胞和H929细胞活性明显下降。　　2、miR175p联合使用ps341能够激活内、外两条凋亡途径。　　第三部分：miR-17的靶点分析　　目的：　　研究了miR175p可能作用靶点。　　方法：　　通过靶点预测软件分析miR17可能靶点。利用双荧光素酶报告基因验证靶点HIF1α。　　结果：　　HIF1α5’UTR存在 miR175p的靶点。HIF-1α-WT/miR-17组 Rluc/luc值明显低于对照组 HIF-1α-WT/NC组，P值＜0.05具有统计学意义。HIF-1α-MUT/miR-17组比值与对照组 HIF-1α-MUT/NC组相比差别不大，也没有统计学意义。　　结论：　　HIF1α可能是miR175p的靶点。　　第四部分：miR-17在蛋白酶体抑制剂ps341抗肿瘤过程中在体研究　　目的：　　通过观小鼠体外Hep G2移植瘤模型观察miR-17在ps341抗肿瘤过程中的作用。　　方法：　　把Hep G2细胞接种于BALB/c Nude裸鼠皮下，观察移植瘤在miR17和ps341作用下移植瘤体积的变化。通过免疫组织化学方法研究HIF1α、Ub、Bax蛋白在在miR17和ps341作用于移植瘤后的变化。利用蛋白印迹的方法研究移植瘤内HIF1α的变化。　　结果：　　1、在观察的30天内，对照组小鼠移植瘤逐渐长大，开始10天生长较慢，第10-25天生长迅速。miR17组和ps341组移植瘤生长也明显受抑制，但从第25天开始两组间出现了差异，miR17对肿瘤的抑制作用大于 ps341。miR17+ps341组对肿瘤的抑制最为明显，从第15天开始移植瘤的生长就明显受抑制，和其他各处理组相比均作用明显，P＜0.05,具有统计学差异。　　2、HIF1α在对照组有较强表达，miR17组看不到表达，而ps341组具有更强表达，miR17+ps341组有一定的表达；Ub在各组中均有表达，但miR17组表达最少，其次为对照组，最强为ps341组和miR17+ps341组。Bax蛋白在各组中也均有表达，但可以看到除ps341组较强外，其他组表达较弱。　　3、各组 HIF1α蛋白的表达有明显差异，对照组有一定的表达，miR17处理组最弱，ps341组最强，其次为miR17a+ Ps341组。　　结论：　　1、miR17+ps341联合使用可以明显抑制移植瘤细胞生长。　　2、miR17能够抑制HIF1α表达。　　第二大部分：去泛素化酶抑制剂ZnPT对肿瘤的作用　　研究背景：　　随着对去泛素化酶的不断研究和深入了解，去泛素化酶已经成为肿瘤治疗的新靶点[20]。目前，已经发现的多种去泛素化酶抑制剂[27]，在体外试验中表现出对肿瘤细胞高度的选择性和安全性，据此可能开发处低毒、特异、高效的抗肿瘤药物[28]。　　Dou[29-31]等研究发现一系列铜配合物如羟基喹啉类铜配合物、双硫仑铜配合物、吡咯烷二硫代氨基甲酸等能抑制糜蛋白酶样活性，且能诱导肿瘤细胞凋亡。此外，铜、金、锌等金属的配合物都具有良好的蛋白酶体抑制活性。本课题组多年来一直致力于蛋白酶体抑制剂和去泛素化酶抑制剂的筛选并且在该领域取得了一定的科研成果。本课题组的相关研究已经发现CuPT和临床药物金诺芬是两个重要的金属19S蛋白酶体相关去泛素化酶抑制剂。　　本课题通过替换Cu配合物为Zn[31,32]，研究金属配合物ZnPT的去泛素化酶抑制活性来发挥其抗肿瘤效应。希望开发出在机制上不同于ps341而疗效上更优的UPS系统抑制剂或去泛素化酶抑制剂。　　目的：　　去泛素化酶抑制剂ZnPT对肿瘤抑制作用　　方法：　　1.通过紫外吸收光谱、EB-DNA激发光谱分析、检测 DNA损伤，通过荧光标记和western blotting方法研究DNA伤相关蛋白的表达。　　2.通过生物分析方法研究去泛素化酶结合位点、去泛素化酶活性以及用竞争性结合方式确定去泛素酶功能位点。　　3.通过MTS实验分析ZnPT剂量依赖性地处理U266细胞、K562细胞、Hep G2细胞、SMMC7721细胞、A549细胞以及A549耐药株。　　4.通过MTS方法研究ZnPT对人肝细胞的活性和正常人支气管上皮样细胞活性有影响。　　5.使用白血病患者肿瘤细胞研究ZnPT作为去泛素化酶抑制剂的效应。　　6.通过PI染色、AnnexinV、凋亡相关蛋白的表达或降解，观查ZnPT促肿瘤细胞凋亡现象。　　7.通过western blotting研究泛素化蛋白聚集和促凋亡相关蛋白。　　8.检测泛素化蛋白底物和GFPu质粒来研究UPS系统活化状态。　　9.通过小鼠移植瘤观察小鼠肿瘤大小、体积、以及组织化学方法观察肿瘤凋亡相关蛋白和UPS状态蛋白。　　结果：　　1.紫外吸收光谱和荧光激发EB实验都可以说明ZnPT对DNA无损伤作用。CDDP(2.5 uM)和ZnPT(2.5 uM)处理A549细胞后，CDDP的γ-H2AX的荧光标记明显增强，处理3h和6h荧光强度较强到12h荧光减弱，而ZnPT检测不到γ-H2AX的荧光，且在各组中没有差异。无论是K562细胞还是A549细胞，在不同浓度ZnPT和CDDP的作用下，所有反应DNA损伤的相关蛋白都表现出来一致的规律，ZnPT处理组除了K562细胞p-ATM外检测不到DNA损伤的相关蛋白，且p-ATM有剂量依赖关系，随着浓度增大而表达增加。CDDP组各DNA损伤的相关蛋白表达明显，且没有明显浓度剂量依赖关系。　　2. ZnPT存在去泛素化酶USP14和UCHL5的空间结合位点。 ZnPT可以明显抑制细胞内去泛素化酶活性，且低剂量下抑制作用已经非常明显。ZnPT可以剂量依赖地与UbVS竞争UCHL5和USP14的活性位点。　　3. ZnPT可以选择性地抑制各种肿瘤细胞。ZnPT剂量依赖性地处理U266细胞、K562细胞、Hep G2细胞、SMMC7721细胞、A549细胞以及A549耐药株后都明显地表现出了剂量效应关系。与对照组相比0.5μmol/L的u已经明显可以抑制细胞活性。同时也可以发现对K562细胞的抑制作用最强，而对A549细胞和A549耐药株抑制较弱。　　4. ZnPT对人肝细胞的活性和正常人支气管上皮样细胞活性有影响，且随着剂量增大而抑制作用更强。但同时也发现这种抑制不呈明显的剂量效应关系。在0.625μMol/L的ZnPT作用下和对照组相比没有明显下降，当浓度加大到2.5μMol/L时突然抑制作用增强。　　5. ZnPT作用于患者肿瘤细胞后可以明显增加凋亡和坏死细胞的数量，并有剂量效应关系。而CDDP组和Vel组也可由细胞凋亡和坏死且Vel组多于CDDP组，但明显少于ZnPT组。 ZnPT作用于患者肿瘤细胞后可以引起肿瘤细胞的凋亡群体增加，并随着剂量的增大而增多。可以看出ZnPT可以导致肿瘤细胞的泛素化蛋白聚集，且呈剂量效应关系。与对照组相比K48的表达也明显增加。随着药物浓度的增加PARP蛋白的裂解带更加明显。　　6. ZnPT对A549细胞有明显的促坏死效应。随着剂量的增加而更明显，但在低剂量时PI染色较弱。ZnPT促A549细胞凋亡的相关蛋白caspase3、8、9均被激活， PARP降解条带清晰可见，呈明显的时间剂量关系。高浓度的ZnPT促A549细胞凋亡导致的PARP切割，以及泛素化蛋白大量聚集均可以被EDTA金属离子螯合剂抑制。　　7.人胚肾细胞 HEK-293在三中蛋白酶体抑制剂作用下均有大量细胞发生凋亡，但b-AP的作用弱于ZnPT和Vel组。人胚肾细胞HEK-293在ZnPT作用下泛素化蛋白及其标志物GFPu呈现明显的剂量效应关系，其他两种抑制剂b-AP和Vel也可以使细胞泛素化聚集。　　8. ZnPT对小鼠移植瘤的抑制从给药第五天开始表现出来，5-11天为抑制高峰。ZnPT对小鼠移植瘤的抑制效果非常明显，对荷瘤小鼠的体重影响不大 ZnPT对移植瘤Ub蛋白、K48蛋白、Caspase3蛋白和P21蛋白的表达均有增加的作用。　　结论：　　1. ZnPT通过选择性抑制26S蛋白酶体相关去泛素化酶来发挥其选择性抗肿瘤效应；　　2. ZnPT抗肿瘤效应机制和激活细胞凋亡通路直接相关；　　3. ZnPT抗肿瘤具有广谱高效低毒的特点。