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疟疾是严重威胁人类健康的寄生虫病，WHO统计资料显示每年确诊的疟疾患者约1亿人。宿主感染疟原虫后，可获得一定的免疫力，但疟原虫在有免疫力的宿主体内仍能生存与繁殖，即疟原虫的免疫逃避。疟原虫可以通过抗原变异、免疫抑制等多种途径逃避宿主的免疫攻击，因此宿主产生的免疫保护常常是不稳固的，但其具体机制仍不甚清楚，给疟疾的研究特别是疟疾疫苗的研究造成了很大的困难。因此，对疟原虫免疫逃避及其机制的研究历来是疟疾防治研究及疫苗研制的热点和难点之一。T细胞免疫调节蛋白（T cell immunomodulatory protein，TIP）是一种新发现的存在于人和多种动物体内的免疫调节分子，它是由612个氨基酸组成的跨膜蛋白。在急性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD）模型小鼠体内的研究发现，TIP可以明显保护因移植物排斥反应而引起的小鼠死亡。本研究通过对疟原虫基因和蛋白质生物信息的对比分析发现，多种疟原虫均存在与TIP氨基酸序列、结构域和三级结构相似的蛋白（以下统称疟原虫TIP样蛋白），推测疟原虫TIP样蛋白在抑制宿主对疟原虫的免疫攻击方面可能也起到重要作用。1．疟原虫TIP样蛋白表达特点及其抗体抑制疟原虫增殖作用的研究本课题组前期根据Plasmodb数据库最初公布的部分编码小鼠伯氏疟原虫TIP样蛋白（以下简称PbTIP）的1566个碱基序列，构建了带GST标签的PbTIP重组原核表达载体。本研究获得PbTIP-GST重组蛋白的表达后，以纯化的重组蛋白免疫家兔，获得了较高滴度的抗PbTIP-GST兔血清。间接免疫荧光实验提示PbTIP主要在疟原虫胞质中表达且分布较均匀，而疟原虫胞核以及被疟原虫寄生的红细胞膜上均未见明显的PbTIP表达。由于目前尚未建立成熟的小鼠伯氏疟原虫体外培养方法。因此，疟原虫生活史不同发育阶段TIP样蛋白的表达水平检测只能在恶性疟原虫体外同步化培养模型中进行。对恶性疟原虫TIP样蛋白（PfTIP）生活史各期表达量的检测发现，滋养体期PfTIP的表达量最高，较裂殖体期高出约6倍多，比环状体期高出5倍多，说明PfTIP发挥功能的主要时期位于红细胞内的发育中期，随着疟原虫发育至裂殖体期PfTIP表达量降至最低水平，提示PfTIP在裂殖子入侵红细胞过程中可能不会发挥太重要的作用。该实验结果与兔抗PbTIP多克隆血清对体外培养恶性疟原虫的生长仅具有较弱的抑制作用相符。重要的是，在PbTIP重组蛋白免疫小鼠的疟原虫攻击实验中发现，以抗PbTIP抗体阻断小鼠伯氏疟原虫PbTIP蛋白的功能后，小鼠抗疟原虫攻击的能力明显增强。推测可能是因为抗PbTIP抗体的存在，抑制了小鼠伯氏疟原虫PbTIP蛋白对宿主免疫应答的负调控作用，导致宿主对疟原虫的免疫应答水平升高，提高了宿主对疟原虫的清除效率。2．伯氏疟原虫PbTIP胞外域重组蛋白对T细胞的作用研究为了明确PbTIP发挥作用的功能区域，本研究根据疟原虫数据库Plasmodb最新公布的小鼠PbTIP全基因序列信息，构建并成功表达了PbTIP完整胞外域的重组蛋白。鉴于第一部分实验中采用pGEX4T-1原核表达载体出现的GST标签与纯化柱结合不良的问题，本研究改用pET32a原核表达载体表达PbTIP胞外域重组蛋白。虽然PbTIP完整胞外域重组蛋白主要以包涵体形式表达，但经过复性后目的蛋白与Ni-NTA Agarose的结合良好，得到了纯化的可溶性PbTIP重组蛋白。但原核表达的PbTIP重组蛋白对CTLL-2淋巴细胞分泌IL-4、TGF-β、IL-10等细胞因子及其增殖水平无明显影响，与预期不符。分析原因可能有两个方面，一方面可能是原核表达的PbTIP蛋白复性后并未很好地恢复天然PbTIP分子原有的空间构象，从而影响其功能的发挥；另一方面也可能是CTLL-2淋巴细胞是IL-2依赖的，在IL-2刺激下，淋巴细胞增殖一直处于较高水平，掩盖了PbTIP蛋白可能的调节作用。3．基因敲除伯氏疟原虫PbTIP为了进一步明确PbTIP是否具有非特异性地抑制宿主免疫应答的功能，本研究尝试敲除编码小鼠PbTIP的基因，深入研究PbTIP在疟原虫免疫逃避中的作用机制。本部分实验基于同源重组原理，首先构建含有抗性筛选标记tg-dhfr/ts的同源重组载体，再将线性化的同源重组载体与同期构建好的TALENs质粒共转染伯氏疟原虫，在小鼠体内通过抗性筛选获得重组成功的疟原虫。但由于疟原虫区别于一般哺乳动物细胞的基因表达调控特点，虽经过多次艰苦的实验仍未获得重组成功的疟原虫。截止目前，本研究仅获得外源线性化基因片段以附加体形式存在的疟原虫，随着疟原虫的扩增和传代外源基因片段随之丧失。当然，我们也不能排除PbTIP基因无法敲除的可能性，即无法排除由于PbTIP基因的敲除而导致疟原虫无法继续存活的可能性。对于TIP样蛋白在疟原虫免疫抑制中的功能研究虽然取得了一些初步的研究结果，但实验中遇到的很多难点尚未攻克，鉴于研究生学习和工作时间有限，相关的研究工作仍在进行中。