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[目的]课题组前期研究表明万古霉素阳离子脂质体复合魔芋葡甘聚糖／纳米羟基磷灰石/壳聚糖(konjac glucomannan/nano-hydroxyapatite/chitosan, KHC)骨替代支架材料对兔感染性骨缺损模型具有良好的抗感染性及骨修复活性,KHC骨替代支架是如何诱导新骨形成是KHC骨替代材料研发过程中必须搞清楚的一个问题,通过体外实验研究KHC骨替代支架对骨髓间充质干细胞、成骨细胞增殖、分化等细胞生物学行为的影响,从BMPs信号通路及FGFS/FGFR信号通路探讨KHC骨替代支架材料的成骨诱导机制。[方法]第一部分1.采用全骨髓贴壁法培养扩增C57BL小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs).通过形态学及生物功能鉴BMSCs。2.在倒置相差显微镜、扫描电镜下观察BMSCs在KHC骨替代支架上的生长、形态和黏附情况。3.KHC骨替代支架与BMSCs复合培养于24孔板中,以单纯的BMSCs培养为阴性对照,以0.64%苯酚与BMSCs复合培养为阳性对照,在24h、48h、72h收集样本,利用MTT法检测BMSCs增殖情况。4. Real-time PCR检测KHC骨替代支架上BMSCs骨钙素(OCN)及Runx2基因的表达,实验分组为：以单纯BMSCs培养作为阴性对照组,以人同种异体脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM)作为阳性对照,阴性对照组：BMSCS+DMEM-F12培养基；阴性诱导组：BMSCs+成骨诱导培养基；DBM组：BMSCs+DMEM-F12培养基+DBM; DBM诱导组：BMSCs+成骨诱导培养基+DBM; KHC组：BMSCs+KHC骨替代支架+DMEM-F12;KHC诱导组;BMSCs +KHC骨替代支架+成骨诱导培养基。通过了解KHC骨替代支架对BMSCs成骨分化的影响,体外研究KHC骨替代支架成骨诱导机制。第二部分1.在倒置相差显微镜、扫描电镜下观察KHC骨替代支架上MC3T3-E1成骨细胞的生长情况。2.KHC骨替代支架与复合培养于24孔板中,以单纯的MC3T3-E1成骨细胞培养为阴性对照,以0.64%苯酚培养MC3T3-E1成骨细胞为阳性对照,分别在24h、48h、72h收集样本,利用MTT法检测KHC骨替代支架对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响。3.Real-time PCR检测KHC骨替代支架上MC3T3-E1成骨细胞Runx2、 BMP-4.BMPRⅠ A、FGFR-1基因的表达,实验分组为：以单纯MC3T3-E1成骨细胞培养作为阴性对照组,以人同种异体脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM)作为阳性对照,阴性对照组：MC3T3-E1成骨细胞-α-MEM培养基;阴性诱导组：MC3T3-E1成骨细胞+成骨诱导培养基；DBM组：MC3T3-E1成骨细胞+α-MEM培养基+DBM:DBM诱导组：MC3T3-E1成骨细胞+成骨诱导培养基+DBM:KHC组：MC3T3-E1成骨细胞+KHC骨替代支架+α-MEM培养基；KHC诱导组：MC3T3-E1成骨细胞+KHC骨替代支架+成骨诱导培养基;[结果]第一部分1.倒置相差显微镜下观察到形态均一、活性及传代能力很强的大量梭形贴壁细胞,成骨诱导培养基培养21天后出现大量钙化结节,证实分离培养的细胞为小鼠BMSCs,并具有良好的成骨分化能力。2.BMSCs与KHC骨替代支架复合培养,细胞生长良好,倒置相差显微镜下观察到材料周围BMSCs生长旺盛,细胞呈梭形,排列有方向性。扫描电镜下观察到大量BMSCs位于支架空隙里伸展良好,细胞伪足之间粘连,黏附于KHC骨替代支架上。3.MTT法检测KHC骨替代支架对BMSCs的增殖能力示：KHC骨替代支架材料组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),KHC骨替代支架与BMSCs共培养24h、48h、72h细胞毒性分别为2级、1级、1级。4.各组成骨基因的表达均高于阴性对照组,化学诱导组成骨基因表达量高于未诱导组,KHC组Runx2在第14天表达上调1.8倍,OCN在第14天表达上调2倍,成骨诱导条件下培养的阴性对照组细胞具有最高的表达水平。第二部分1. MC3T3-E1与KHC骨替代支架复合培养,细胞生长良好,倒置相差显微镜下观察到材料周围MC3T3-E1生长旺盛,细胞呈梭形,排列有性方向。扫描电镜下观察到KHC骨替代支架孔隙间有大量MC3T3-E1成骨细胞长入,细胞伪足互相连接,黏附于KHC骨替代支架上。2.MTT法检测KHC骨替代支架对MC3T3-E1成骨细胞的增殖能力示：KHC骨替代支架材料组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),KHC骨替代支架与MC3T3-E1成骨细胞共培养24h、48h、72h细胞毒性分别为1级、1级、1级。3.2W时各组BMP-4表达水平达到最高,KHC诱导组BMP-4明显高于其他组,3w时各组BMP-4表达量均略有下降。随着时间推移KHC组BMPR I A表达量逐渐升高,第3w时达3.2倍。阴性诱导组Runx2在2w时表达量达到最高,KHC组在1w和3w时表达受抑制,在2w时表达量达最高,在3w时DBM组Runx2表达量达最高。FGFR-1在第1w、2w时表达受到抑制,各组均在第3w时达到表达最高峰。[结论]1.全骨髓贴壁法在体积分数为5%CO2、饱和湿度37℃的孵箱中用10%FBS的DMEM-F12培养基可以在体外培养扩增小鼠BMSCs。2.BMSCS在KHC骨替代支架上铺展良好,KHC骨替代支架通过刺激Runx2、OCN表达,激活BMPs、MAPK、Wnt等成骨相关信号通路,促进新骨形成。另一方面,KHC骨替代支架通过细胞黏附改变细胞形态,改变细胞内力学传导效应,激活成骨相关信号通路,进而促进成骨分化。3.KHC骨替代支架通过诱导BMP-4、BMPR I A激活BMPs信号通路,进而活化Runx2,促进成骨细胞成熟。另一方面KHC通过诱导FGFR-1表达,激活FGFs/FGFRs系统,进一步激活Runx2、BMPs,调控成骨分化,促进新骨形成。