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目的：
以复制缺陷型重组腺病毒为载体携带可溶性血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)基因silk-1，体外观察sFlk-1的表达分泌对于血管内皮细胞增殖的抑制能力，并进一步深入研究Ad.sFlk-1在体内对大鼠角膜新生血管及肿瘤新生血管的抑制作用。并以VEGFR2膜内段Flk-1/KDR激酶为靶点，设计Flk-1/KDR激酶抑制剂的药效团模型，阐明Flk-1/KDR激酶抑制剂的结构特征，以期发现新的、潜在的Flk-1/KDR激酶抑制剂先导化合物分子。
方法：
CMV作为启动子的重组复制缺陷型腺病毒载体Ad.sflk-1，经空斑筛选、扩增、密度梯度超速离心纯化和滴度测定。Westernblotting检测Ad.sFlk-1在人视网膜色素上皮细胞ARPE-19、人脉络膜恶性黑色素瘤细胞OCM-1中的表达。CCK-8显色评估Ad.sflk-1感染ARPE-19、OCM-1细胞的条件培养基对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的抑制效果。然后，构建SD大鼠角膜新生血管模型和人脉络膜恶性黑色素瘤裸鼠模型，进一步研究以VEGF为靶点的Ad.sFlk-1在体内对新生血管形成及肿瘤生长的抑制作用。计算机辅助设计Flk-1/KDR激酶抑制剂的三维药效团模型，并将药效团模型作为提问结构进行中药化学数据库(TraditionalChineseMedicinesDatabase，TCMD)虚拟筛选，发现新的潜在先导化合物分子，通过分子对接的方法来进一步阐明Flk-1/KDR激酶与其小分子抑制剂的相互作用机制。
结果：
1.Ad.sFlk-1体外对血管内皮细胞增殖的抑制实验与对照组Ad.null比较，Ad.sflk-1感染ARPE-19细胞、OCM-1细胞后的条件培养基对VEGF诱导的HUVEC血管内皮细胞增殖的抑制分别达到58.39％和58.10％。
2.Ad.sFlk-1体内对新生血管生长的抑制情况在SD大鼠角膜碱烧伤后，Ad.sflk-1治疗组角膜新生血管生长抑制效果明显。在碱烧伤第7天，Ad.null和PBS对照组中，角膜新生血管严重程度达到“++～+++(moderatetosevere)”的比例分别为62.5％和75.0％，而Ad.sflk-1治疗组的比例为0％，与对照组比较，新生血管严重程度等级明显较小(p＜0.005)。在碱烧伤第14天，Ad.null和PBS对照组中，角膜新生血管严重程度达到“++～+++”的比例分别为75.0％和87.5％，Ad.sflk-1治疗组的比例仍为0％，与对照组比较，新生血管严重程度等级差异显著(p＜0.005)。
免疫组织化学染色发现，治疗组前房Ad.sflk-1注射后，在角膜内皮细胞和角膜基质检测到目的蛋白sFlk-1的表达，Ad.null和PBS对照组的角膜组织中没有检测到sFlk-1的表达。
3.Ad.sFlk-1体内对肿瘤生长的抑制作用肿瘤生长曲线显示：从治疗开始后的第8天起，Ad.sflk-1治疗组，与Ad.null和PBS对照组相比，肿瘤生长减慢。
治疗结束时，Ad.null和PBS对照组、Ad.sflk-1治疗组，裸鼠移植瘤体积分别为：2021.12±504.18mm3、1917.48±234.01mm3、713.03±236.18mm3。统计学分析，Ad.sflk-1治疗组与Ad.null、PBS对照组比较，裸鼠移植瘤体积明显较小(p＜0.05；p＜0.05)。处死小鼠后剥离肿瘤，称取肿瘤的重量。与Ad.null、PBS对照组比较，Ad.sflk-1治疗组的肿瘤抑制率分别为53.05％和52.41％。
病理切片发现肿瘤经过Ad.sflk-1治疗后，肿瘤内有广泛的坏死。对照组病理切片无明显坏死区域。免疫组织化学染色显示治疗组微血管密度(MVD)低于于对照组。经统计学分析，治疗组平均微血管密度为5.87±0.27，Ad.Null、PBS对照组平均微血管密度分别为13.03±0.39、12.50±0.35(p＜0.05；p＜0.05)。Ad.Null对照组与PBS对照组比较，平均微血管密度没有显著性差别(p＞0.05)。
4.Flk-1/KDR激酶抑制剂效团模型设计和数据库筛选由28个已知的Flk-1/KDR激酶小分子抑制剂组成的训练集分子，经CATALYSTHypoGen软件计算分析，得到打分评价最好的药效团模型Hypol(△cost=75.184，correlation=0.911)。对药效团模型Hypol的合理性进行评价，结果显示药效团模型Hypol能够较准确地预测训练集分子和测试集分子的IC50值，说明药效团模型Hypol是合理的，并具有较好的预测能力。将药效团模型Hypol作为提问结构进行中药化学数据库筛选，搜索到一个打分评价较高、并且符合“类药五原则”的目标小分子化合物(分子编号：Compound_Number_5688)。Flk-1/KDR激酶(PDBcode:1YWN)与目标化合物进行柔性分子对接，对接结果与Flk-1/KDR激酶与其抑制剂4-氨基-呋喃并[2,3-d]嘧啶(4-amino-furo[2,3-d]pyrimidine)的复合物晶体结构(PDBcode:1YWN)中所得到的蛋白质受体一小分子配体相互作用模式相似。
结论：
复制缺陷型腺病毒载体Ad.sFlk-1在体外可以很好的抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖。体内实验表明，通过局部注射Ad.sFlk-1对角膜新生血管和肿瘤血管生成有明显抑制作用。Hypol药效团模型概括了Flk-1/KDR激酶抑制剂的特征，该方法为专一性小分子抑制剂的设计提供了思路，同时为抗新生血管生成基因治疗提供理论依据。