【摘 要】
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微流控芯片技术是微全分析系统研究领域的重要组成部分,其最终目的是将生物、化学、医学等领域中所涉及的细胞培养、分选、裂解、样品制备、核酸提取、反应、分离、检测等常规
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微流控芯片技术是微全分析系统研究领域的重要组成部分,其最终目的是将生物、化学、医学等领域中所涉及的细胞培养、分选、裂解、样品制备、核酸提取、反应、分离、检测等常规实验室的各种操作单元集成到一块芯片上,实现“样品进入-结果输出”的目标。本文在该理念下将这一技术用于植物病毒检测的研究中,具体工作如下: 1.针对选择的研究对象设计并筛选引物。根据前人研究结果,目前微流控芯片上进行的芯片PCR的温度控制尚未达到常规PCR仪所具有的精确度和稳定性,加之退火温度在最佳Tm值的上下小范围内,就可以保证目的基因的成功扩增,因此对引物的特异性、稳定性方面要求较高.本文就番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)分别设计、筛选、验证引物,分别获得14对和8对备用引物,为植物病毒微流控芯片PCR扩增及其与芯片电泳的集成检测研究奠定基础。 2.优化微流控芯片电泳条件,并将琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳进行比较.运用控制变量法,对微流控芯片电泳具有重要影响的参数进行优化,得到聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate,PMMA)芯片对应的分离胶的最佳配比为990μL[3×TTE+3%(PVP70%+ HEC30%)]+10μL(100×SYTOX Orange dye),最佳进样电压、分离电压分别为400V和700V,进样时间为30s。微流控芯片电泳较琼脂糖凝胶电泳在检测时间上至少减少10倍;试剂消耗为后者的1/8,降至到1μL之内;灵敏度较后者至少高出103倍,可准确检测到5×10-6μg/μL,有望在作物病毒病显症之前发挥筛查和预防方面的巨大作用。 3.微流控芯片对植物病毒的集成检测.把微流控芯片PCR和微流控芯片电泳在同一玻璃芯片上进行,实现了植物病毒的核酸PCR过程与随后产物电泳检测的集成,在提高检测灵敏度的同时,进一步缩短检测时间,减少了人工操作,避免因样品转移带来的污染,推动植物病毒检测走向集成化、自动化操作。
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