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背景和目的小分子热休克蛋白作为一类在进化上高度保守的蛋白,其在哺乳动物中生物学作用的重要性早已引起广泛关注。该家族中的Hsp25(鼠源)分子量为25kDa；而其人源的同源蛋白为Hsp27,分子量为27kDa。研究表明,Hsp25/Hsp27与心血管疾病发生发展之间存在重要关系。本课题组以往研究表明,过表达Hsp27能减轻急性心肌缺血/再灌注损伤,缩小心肌梗死面积,提示Hsp25/Hsp27具有潜在的心脏保护功能。但是Hsp25/27对心肌梗塞后的心肌重塑、中长期存活率的影响,都不清楚。因此,本课题组前期在构建Hsp25心肌特异性敲除小鼠基础上,发现Hsp25基因缺失显著增加心肌梗塞小鼠的死亡率,其死亡原因主要是心脏破裂。本实验将从细胞外基质重塑的角度,探讨Hsp25基因对心梗后心肌间质重塑的影响,以期为揭示Hsp25对心梗后疤痕修复的调节作用提供理论依据。实验方法1动物模型：本实验室通过与南京大学模式动物研究所合作构建了Hsp25基因心肌特异性敲除小鼠(Hsp25knockout mice,Hsp25KO),饲养在南京大学模式所的无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)动物房中。对照组为具有同样背景的野生型小鼠(Wild Type,WT)2小鼠基因型的鉴定：1)用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)确定小鼠的基因型；2)用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠心肌中Hsp25的蛋白表达水平。3小鼠心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)模型的构建：戊巴比妥纳麻醉小鼠后,取仰卧位,呼吸机机械通气。备皮、开胸、暴露出心脏,撕开心包膜,在冠状动脉左前降支三分之一处进行永久性结扎,关胸,缝皮,30min之后撤下呼吸机,让小鼠自然苏醒。4心功能评价：分别对假手术(sham)、MI后1天、3天的KO小鼠和WT小鼠进行异氟烷气体麻醉,取仰卧位,使用超声心动图测定心脏多项心功能指标,包括左心室射血分数(EF%)、心室短轴缩短率(FS%)、舒张期左室内径(LVIDd)、收缩期左室内径(LVIDs)等。5小鼠心脏组织分区分离：断颈处死小鼠,迅速开胸,将心脏取出置于4℃的PBS中,首先截取结扎线以上的组织为梗死远端区(Infarct remote left ventricle;Infarct remote LV)；剩下的组织按照梗死界限进行分离,梗死的区域称为(Infar leftventricle;Infarct LV);另一部分组织称为梗死周围区(Infarct border left ventricle; Infarct border LV)。6细胞外基质的胶原检测：将梗死区的心肌置于戊二醛固定,送至南京医科大学电镜室进行制片,透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察心脏组织超微结构变化。7统计学方法：使用SPSS17.0进行数据处理。数据以均数士标准差(x士s)表示,两组数据之间的比较用两样本均数检验(t检验),多组数据之间的比较用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著性差异。实验结果1WT鼠心肌梗死后,其心肌中的Hsp25蛋白表达量会随着时间的延长而逐渐上调。2构建Hsp25心肌特异敲除的小鼠模型,其野生型(WT)小鼠的心肌中的Hsp25表达水平正常,而基因敲除型(KO)小鼠心肌中的Hsp25表达水平与之相比明显下降。3Hsp25基因敲除后,不影响小鼠的正常发育以及生殖功能。4小鼠MI后,在统计的两周时间内WT小鼠的存活率在75%,而KO小鼠与之相比,其存活率明显下降,并且在造模后的五天时间内全部死亡,尸体解剖发现90%的小鼠是因为心脏破裂而死。5MI后1天和3天的心功能追踪显示,KO小鼠心功能较WT小鼠显著降低。6通过对MI后1天后3天的心脏梗死区的的细胞外基质研究发现,KO小鼠的Ⅰ型和Ⅲ型胶原较WT小鼠在蛋白水平有明显下降。7通过对MI后1天后的心脏梗死区的的细胞外基质研究发现,KO小鼠的基质金属酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和9较WT小鼠在蛋白水平有明显升高。结论Hsp25基因对于心肌梗死的创伤修复存在保护作用,该作用与调节细胞外机制重塑有关。