论文部分内容阅读
本论文通过分子克隆手段得到中国青岛文昌鱼的3个死亡受体基因(分别命名为91614，91616和91618)。序列分析显示，文昌鱼3个死亡受体胞外识别配体的区域和TRAIL受体OPG(TNFR家族成员之一)的同源性最高，我们预测这3个死亡受体可能是TRAIL识别受体的祖先分子。系统进化分析推测文昌鱼死亡受体的产生源于一次TNFR胞外区与FADD死亡结构域的重组事件。成体原位杂交实验证明文昌鱼3个死亡受体主要在消化道、肝盲囊、性腺和皮肤等免疫相关的组织进行表达，在LPS刺激后表达有小幅上调，印证了这类凋亡相关的受体分子可能参与文昌鱼的免疫反应。转录本研究表明91616和91618具有多种剪接体，亚细胞定位实验表明文昌鱼死亡受体能够准确定位于HEK293T和Hela细胞的细胞膜上，而缺失了信号肽或者胞内死亡结构域的剪接体则不能进行准确的定位。进一步的功能研究表明过表达文昌鱼的死亡受体能够依赖其胞内的死亡结构域引发Hela细胞发生凋亡，但该类基因的过表达并不激活NF—κB、AP-1等核转录因子，这说明在文昌鱼中出现的死亡受体不仅仅具有完整的结构，而且已经能够发挥诱导细胞凋亡的功能，同时不同剪接体可能提供了完善的调控机制。
本论文还克隆得到凋亡信号通路中另一个关键的接头分子并命名为BbtCRADD，且对该分子及本实验室已经得到的BbtFADD1和BbtFADD2分子进行了详细的细胞定位分析和初步的功能验证。结果显示BbtFADD1和BbtCRADD主要在细胞质中形成丝状结构，而BbtFADD2在细胞核内呈点状或丝状分布。和哺乳动物FADD和CRADD的细胞定位进行比较分析，表明文昌鱼的这类分子可能已经具备了寡聚化后诱导细胞凋亡的活性，提示我们经由FADD和CRADD募集caspase诱导凋亡的信号通路在文昌鱼中已经形成。然而，意外的是我们发现这三个分子在Hela细胞和293T细胞中过表达均不能诱导细胞凋亡，相反，BbtFADD1能有效地激活NF—κB这条抗凋亡的信号通路。这提示我们虽然FADD分子保守地在果蝇直到脊椎动物中存在，但在不同的进化阶段，它们所发挥的功能不尽相同。而文昌鱼三个死亡受体是否可以募集这类分子进行下游的信号传递还有待进一步的研究。
总的来说，本论文的发现重新定义了TRAIL受体的出现始于文昌鱼，其首次出现即经历了倍增。不仅如此，这类原始的基因还存在着复杂的多剪接体形式，这表明该类基因在脊椎动物祖先中已经出现并具备了可调节的、诱导凋亡的功能。多剪接体的形式暗示了其功能的复杂性和新颖性，同时多接头分子的存在和功能的分化也表明一个初具雏形的死亡信号传导系统的存在，将死亡受体的进化和研究向前推进了一大步。