凝集素是一种能与单糖或多糖可逆性结合的蛋白质或糖蛋白的总称，通常含有一个或多个非催化性结构域。它们在自然界中分布十分广泛。其中 II型核糖体失活蛋白类凝集素由 A, B两条链组成，A链具有核糖体失活蛋白活性，B链具有凝集活性。核糖体失活蛋白可通过专一性地水解真核生物核糖体28S rRNA第4324位上的A碱基与核糖间的 N-糖苷键进而抑制蛋白的合成。课题组前期研究获得的苦荞麦凝集素(TBL)属于一种 II型核糖体失活蛋白。但其生物学功能和酶学活性有待深入了解。本研究构建了一种包含 A4324位点的双荧光素酶质粒psiCHECKTM-2-F28RNA，用具有N-糖苷酶(EC3.2.2.22)活性的苦荞麦凝集素与 psiCHECKTM-2-F28RNA进行体外孵育，琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示 TBL可以将质粒由超螺旋型切割为缺刻型。将psiCHECKTM-2-F28RNA转染 HCT116细胞，发现海肾荧光/萤火虫荧光比值也明显降低，表明构建的该质粒可以用于检测核糖体失活蛋白对细胞的毒性作用。当将 psiCHECKTM-2-F28RNA中的 GAGA序列分别突变后进行同样实验，确定该质粒中的GAGA为核糖体失活蛋白的识别位点。进一步构建包含GAGA特征序列的Wnt1-3UTR区的质粒 psiCHECKTM-2-Wnt1-3UTR，实验也发现，在胞外和胞内 TBL与 psiCHECKTM-2-Wnt1-3UTR都具有相互作用，表明细胞内具有 GAGA序列的 mRNA也可能成为核糖体失活蛋白的靶点。同时，本实验还提取了多种食源性作物中的蛋白质，分别与 psiCHECKTM-2-F28RNA相互作用，结果显示该质粒能快速地检测筛选不同生物体内的核糖体失活蛋白。可用于核糖体失活蛋白的快速筛选和酶活性鉴定。　　为了进一步研究 TBL的生物学功能，拓展其在抗肿瘤方面的应用，制备了TBL的多克隆抗体。通过离子交换色谱和分子筛层析等方法提取纯化及浓缩获得浓度大约为2 mg/mL的目的蛋白 TBL。采用纯化的 TBL对大鼠进行3次免疫，30天后获得抗 TBL的多克隆抗体，经过 ELISA测定效价，1、2、3号大鼠血清效价达到1:2560000(P/N>2.1)，4、5号大鼠效价达到1:5120000(P/N>2.1)，TBL的多克隆抗体的成功制备为后续研究奠定了基础。　　前期通过 MTT实验对 TBL抑制细胞增殖作用的测定发现 TBL对肠癌细胞HCT116的增殖产生十分显著的抑制效果，而对 Hep G2细胞影响相对较小，对正常细胞 FHC几乎没有影响。之后的研究证明，这种现象可能与 Galectin-3的表达有关。Galectin-3是 Galectin家族的成员之一，在肿瘤的转移浸润等生理以及病理过程中起重要作用。本研究通过免疫荧光观察发现 Galectin-3在肠癌细胞 HCT116中较肝癌细胞 Hep G2及正常肠细胞 FHC表达量高且分布于细胞膜表面。而同等条件下 TBL处理上述三株细胞后，TBL能在 HCT116细胞膜表面大量分布，在其他两株细胞膜分布不甚明显。Western blot分析证明，TBL与 Galectin-3在细胞膜表面存在某种竞争关系，TBL通过竞争结合细胞膜表面 Galectin-3识别的受体，导致细胞膜表面的 Galectin-3结合量大大减少，降低了细胞的浸润性。同时，细胞膜表面受体招募了大量的 TBL，使得细胞表面 TBL大量聚集而增加了 TBL进入胞内的几率与浓度。依据这些实验结果，我们推测，胞质中的 TBL可能通过其核糖体失活蛋白的功能，对胞内 RNA进行切割破坏，导致细胞翻译过程受阻，进而引起细胞死亡。　　凝集素由于其特有的生物学功能性质及可能的细胞毒性，近年来已成为医药和生物学领域的研究热点，首次从蓼科植物苦荞麦中获得一种兼具核糖体失活蛋白活性的凝集素，对其可能的抗肿瘤活性进行了初步研究，有关 TBL对 RNA的切割功能及影响蛋白质的翻译，导致细胞死亡的作用方式及机理有待深入研究。