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目的:本研究采用膜表面标志CD4+CD25+CD127low/-来界定调节性T细胞(regulatory T cell,Treg),探讨其与Foxp3的一致性;评估CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞对CD4+CD25-CD127+效应T细胞增殖的影响;并评价其与胃癌TNM分期的相关性及术后状况。
方法:1 流式细胞术以CD4、CD25、CD127和(或)Foxp3抗体染色,分选鉴定CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞Foxp3mRNA和蛋白水平的表达情况,分析CD25+CD127low/-与Foxp3+界定Treg细胞的相关性。2 流式细胞术无菌分选CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞与CD4+CD25-CD127+效应T细胞,经荧光染料CFSE染色后,以CD3、CD28单抗刺激和IL-2维持,按两群细胞不同比例模式共培养,7天后收集细胞检测,ModFit软件分析增殖状况。3检测57例不同分期胃癌患者外周血、腹腔积液、癌旁淋巴结和肿瘤组织中CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞的表达情况,以20例健康人外周血为对照;并对其中8例手术后3个月复测外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞。
结果:1 CD4+CD25+CD127low/-标志组合界定调节性T细胞的Foxp3蛋白表达率为88.1~95.2%,Foxp3mRNA水平高表达。而CD4+CD25-CD127+T细胞的Foxp3蛋白表达率为0.5~2.8%,Foxp3mRNA几乎不表达。CD4+CD25+CD127low/-T细胞与CD4+CD25+Foxp3+T细胞具有极强的相关性(r=0.986,P<0.01)。2 CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞与CD4+CD25-CD127+效应T细胞共培养,当比例为1:1(即细胞数为1×105:1×105)时,T细胞的增殖明显受到抑制;当比例为1:3(即细胞数为1×105:3×105)时,T细胞的增殖状态一般;而当只有CD4+CD25-CD127+T细胞时(即细胞数为0:3×105),细胞增殖非常明显。3 57例胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞的比例为7.77±1.52%,与健康对照5.49±0.86%相比较,具有显著差异(P<0.01),在腹腔积液中为10.75±2.36%、癌旁淋巴结为中18.36±3.00%、肿瘤组织中为21.08±3.70%;外周血TNMⅠ期为6.09±0.92%、Ⅱ期为6.61±1.01%、Ⅲ期为8.17±1.23%、Ⅳ期为9.01±1.00%,与健康对照相比较,TNMⅠ期时无显著差异(P﹥0.05),而TNM Ⅱ期后差异有显著性(P<0.01);腹腔积液中TNMⅠ期为7.88±0.95%、Ⅱ期为9.14±1.14%、Ⅲ期为11.04±1.78%、Ⅳ期为13.15±1.70%;癌旁淋巴结中TNMⅠ期为14.33±1.12%,Ⅱ期为16.16±1.16%,Ⅲ期为18.76±1.67%,Ⅳ期为21.69±2.12%;肿瘤组织中TNMⅠ期为16.51±1.44%,Ⅱ期为18.00±1.60%,Ⅲ期为22.03±2.23%,Ⅳ期为24.59±3.12%;8例患者外周血CD4+CD25+CD127low/- Treg细胞术后3个月明显下降(9.13±1.24% vs 5.73±0.83%,P<0.01)。
结论:CD4+CD25+CD127low/-膜表面标志是鉴定Treg细胞的特异性抗体组合,与Foxp3标志具有高度的同一性,CD127可以作为Treg细胞体外功能实验和体内治疗研究一项新颖的标志物;CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞能够抑制CD4+CD25-CD127+效应T细胞的增殖;胃癌患者肿瘤微环境中CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞的比例明显升高,其增高程度与肿瘤TNM分期呈显著正相关。