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目的:犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病,该病给全球犬科、皮毛动物及肉食野生动物造成了巨大威胁。CDV的H基因易发生变异,给疾病的防控带来很大的困难。因此适时掌握CDV流行毒株的分子特征并进行快速诊断对防控该病具有重要意义。本试验期望建立一种检测CDV野毒株的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法(real-time PCR),为CDV的鉴别诊断提供新的技术支持。为验证该方法在临床应用上的准确性,本试验对23个临床CDV毒株进行遗传变异分析,同时也丰富了CDV野毒株的基因组数据。试验1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测CDV野毒株方法的建立和应用方法:本试验根据GenBank中CDV疫苗株(CDV3:DQ778941;Onderstepoort:EU143737;Snyder Hill:AF259552;Convac:Z35493)和国内野毒株(Sichuan06:JX406739)的H基因差异区域,设计合成一对特异性扩增野毒株的引物,建立了一种检测CDV野毒株的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。以野毒株的cDNA为模板构建重组质粒,测定其OD260值和OD280值并换算成拷贝数。在优化确定荧光定量最佳反应体系和程序后,将重组质粒10倍倍比稀释并绘制标准曲线和溶解曲线,并对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行评价。将建立的real-time PCR方法运用于临床收集的95份CD样品,并与普通PCR进行比较。结果:重组质粒拷贝数为6.22×109copies/μL;最佳引物终浓度为0.4～0.6μM,最佳退火温度为57.6～61.6℃;标准曲线的相关系数R2=0.987,扩增效率E=102.7%,线性关系良好;溶解曲线呈单一波峰,溶解温度Tm=82.50℃;该方法能特异性地检测CDV野毒株,与CDV疫苗株、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒均无交叉反应;该方法检出敏感度达6.22×101copes/μL,比常规PCR敏感度高100倍;具有良好重复性,批内和批间重复试验的变异系数均低于1%;在95份临床CD样品中,本试验建立的real-timePCR方法检出89份为野毒株感染,检出率为93.68%,而普通PCR检出78份的CDV野毒阳性样品,检出率为82.11%。试验2四川CDV流行毒株的遗传变异分析方法:分别从试验1检测结果为阳性和阴性病料中随机选择共23份样品,进行H全基因扩增并克隆,测序后利用DNAMAN7.0、MEGA6和NetNGlyc1.0软件分析,参考国内外已经发表的38个H基因序列进行比较,并验证试验1所建立检测CDV野毒株方法的可靠性。结果:遗传变异分析表明,除C11和C53毒株外,其余21个CDV病毒均为Asia-Ⅰ型,核苷酸(氨基酸)同源性为97.1%～99.9%(97.7%～99.8%),有8～9个N-糖基化位点,C24毒株发生Y549H突变;C11毒株属于Asia-Ⅳ基因型,与其它毒株间的核苷酸(氨基酸)同源性为92.9%～93.6%(93.9%～95.4%),有8个N-糖基化位点,并发生G530D、K213T、L272M、N427Y、M235V、A298D、I506T和A588S突变;C53毒株属于America-Ⅰ型疫苗株,与CDV3疫苗株遗传距离最近,与其他毒株间的核苷酸(氨基酸)同源性为90.6%～91.4%(90.2%～91.7%),仅有7个N-糖基化位点;遗传变异分析结果与试验1的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法检测CDV野毒株的结果一致。