【背景】1.关于PBDEs(多溴联苯醚)多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是溴代类化合物,常作为阻燃剂加到油漆,塑料,纺织,电子电器等人造产品中,目前已广泛应用于电子、电脑和泡沫等家具中。自20世纪70年代生产和使用多溴联苯醚至今,已造成多溴联苯醚的全球性环境污染。有资料显示,发达国家80 %的电子垃圾进入中国、印度和巴基斯坦等国,其中中国又占了90 %,导致城市的户外空气中PBDEs浓度比农村空气中的10倍还多,在我国一些地区已形成了电子垃圾拆解集散地,原始的拆解手段(露天焚烧、烘烤和酸洗等)使PBDEs等持久性有毒污染物不断向周围释放,严重污染了当地环境,危害人体健康.由于PBDEs具有难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用,能够通过食物链的转移,使生物受到毒害,最终导致对人体健康的危害。研究表明,20世纪80年代初以来,环境中和人母乳中多溴联苯醚不断以指数形式增加,这与全球PBDEs需求的增长是一致的。PBDEs在环境中能稳定存在,并可沿着食物链传播,最终通过食物、母乳、大气和室尘等蓄积在人体内.目前研究认为,PBDEs(主要是低溴类)进入机体后多数积累在脂肪组织,对机体健康产生不良影响。PBDEs在鼠类脂肪组织中的半衰期为19-119天,含溴越多的PBDEs同系物,半衰期越长。多溴联苯醚对试验动物有致癌性、生殖毒性、神经毒性和内分泌干扰毒性,因此,在美国及欧洲等地,相继限制生产和使用低溴类如BDE-47,99,153等,但高溴类如BDE-209因其阻燃性好,其生物毒性不确定而仍在广泛使用。人们对PBDEs毒性的了解远不如PCBs。目前,实验室研究证据积累相对较多,而人群研究对象主要是职业人群,数据相对缺乏。不同职业的人群中PBDEs同系物的分布不完全相同。对荷兰,美国,瑞士及中国人群调查发现,多溴联苯醚产品中,非职业暴露人群体内主要BDE-153,职业暴露人群体内主要BDE-209和BDE-183。2.关于BDE-209(十溴联苯醚)十溴联苯醚(Brominated Diphenyl Ethers-209 ,BDE-209)是一种含有十个溴原子的多溴联苯醚,具有稳定性好,添加量少,价格便宜等优势,据统计2001年十溴联苯醚在所有PBDEs中使用占83.3%,其次就是BDE-206, BDE-208, BDE-207, BDE-203, BDE-47, BDE-153,2004年在中国十溴联苯醚使用量达到25000吨,从2000年至2005年国内使用含有十溴联苯醚的材料增加了200%,从1万吨至约3万吨。因生物蓄积作用,BDE-209在血液中的浓度还将继续升高。已经在各种环境介质(如大气、沉积物、土壤、室内空气以及各种生物体等)和人体中检测出,并且含量逐年增加。十溴联苯醚排放到环境中后,经光解、高温分解、生物及微生物降解等过程,会转化为多溴二苯并二恶英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚,更容易进入生物体,引起更强的毒性作用。试验也证明BDE-209具有神经发育毒性,免疫毒性,内分泌毒性以及致癌性等。有研究者认为高溴类PBDE在围产期暴露可以导致仔鼠成年后的神经自发行为以及学习记忆能力的影响。我们在前期实验中也证实一定剂量的母源性BDE-209暴露可损伤子鼠神经系统发育,导致其神经行为的改变;BDE-209的神经发育毒性与其仔鼠神经细胞氧化损伤及细胞凋亡升高有关,一定剂量BDE-209导致体外培养神经细胞结构及功能改变。也有很多学者认为BDE-209在体内代谢快,蓄积低,在常规暴露水平对机体不造成影响,并且认为BDE-209是阻止了大量火灾发生的功臣,由于目前国际上对BDE-209致生物健康的影响存在争论,所以仍然有必要进一步开展BDE-209对生物健康影响的研究。3.关于神经干细胞(NSCs)新记忆的形成,旧记忆的回想,学习能力的建立都与脑部海马(hippocampus)部位有关。近年来,神经干细胞的发现,为学习记忆机制的研究提供了一个新的视点。有报道神经干细胞分裂增殖越多,动物的学习记忆能力越强。神经干细胞分裂增殖可能对学习记忆起调控的作用。在哺乳动物胚胎期,神经干细胞(neural stem cell,NSCs)主要分布在海马、大恼皮质、纹状体、室管膜下层和中脑等区域。成年后在侧脑室下区(subventficalar zone。SVZ)、海马齿状回(dentategyrus,DG)的颗粒细胞下区、纹状体、脊髓等处也发现存在NSCs。神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞,它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞.现发现NSC的生物学特征为:(1)具有自我更新能力;(2)具有多向分化潜能,可分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞;(3)处于高度未分化状态;(4)终生具有增殖分化能力,在有损伤的局部环境信号变化的刺激下可以增殖分化。其中(1)和(2)是NSC的两个基本特征。NSC的增殖和分化调控是目前NSC研究的核心问题,最近的研究资料显示,NSC的增殖、分化、迁移调控受多种相关因素的影响。大致分为:①内源性因素:指可以对外界信号发生反碰并通过一系列的信号转导途径调节自身NSCs的因素.包括一些NSCs内的蛋白成分、各种因子(如EGF、FGF、IGF等)、离子、激素以及神经介质,都是NSCs赖以存在和分化的必要因素,另外,一些转录因子和基因的激活与沉默也可影响NSCs的分化方向。②外源性因素:包括葡萄糖、氨基酸、维生素等是维持细胞存活的基本元素.细胞间各种因素的协调平衡、渗透压、pH值、氧浓度和温度等都对NSCs的增殖、迁移以及分化产生重要影响.另外.某些病理状态如脑缺血也是NSCs的激活因素。本课题从细胞水平,选取不同浓度的十溴联苯醚作为目标化合物,体外传代培养新生鼠海马神经干细胞,用不同浓度的BDE-209对新生鼠海马神经干细胞进行染毒,观察神经干细胞形态,检测NSCs的增殖分化及凋亡状况,以此来研究BDE-209对神经干细胞的影响,探讨神经发育与环境因素的关联,初步探讨BDE-209神经毒性作用机制,本课题分为以下四个部分进行各项具体实验。第一部分BDE-209对体外培养新生鼠海马神经干细胞的形态学的影响【目的】取新生1天SD大鼠的海马组织进行无血清传代培养,鉴别神经干细胞的纯度,染毒后测量形成神经球数量及神经球直径,观察BDE-209对体外培养新生鼠海马神经干细胞形态的影响。【材料与方法】1.购买新生1天SD大鼠,取大鼠海马组织进行体外神经干细胞培养。2.培养3-4代后海马神经干细胞进行神经干细胞鉴定及纯度鉴别。3.传代培养3-4代的新生鼠海马神经干细胞吹打成单细胞悬液后,暴露于BDE-209,实验共分5组,空白对照组,DMSO对照组,实验A组:BDE-209浓度为10ug/ml,实验B组:BDE-209浓度为30ug/ml,实验C组:BDE-209浓度为50ug/ml。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液。4.染毒72h后,在倒置显微镜下进行神经球形态观察,利用美国Image-Pro-Plus 6.0图象分析软件记数形成神经球的数目,测量神经球的平均直径。【结果】1.神经干细胞鉴定结果:海马组织培养经3-5天可见神经球形成,6-7后见神经球逐渐增大,经免疫细胞化学染色证实新形成的神经球呈现Nestin免疫染色阳性,提示所分离培养的细胞是神经干细胞。2.海马神经干细胞培养3-4代后在倒置显微镜下观察,由数十到数百个细胞聚集形成大小不等的神经球,折光性强,周围光晕明显,吹打成单细胞悬液后行免疫细胞化学法鉴定神经干细胞的纯度。由结果可见分散的神经干细胞是主体,可占90%以上。3.利用美国Image-Pro-Plus6.0图象分析软件记数形成神经球的数目,测量神经球的平均直径可见:实验组可见神经球数目明显减少,且神经球平均直径明显减小,随着BDE-209浓度加大,神经球数目减少,平均直径减小。【结论】以上提示:所分离培养的细胞形成悬浮生长的神经球,经免疫细胞化学鉴定是神经干细胞。BDE-209可以导致新生鼠海马细胞形成神经球数目及直径改变,随BDE-209浓度增加形成神经球数目及直径有不同程度的下降。第二部分BDE-209对体外培养新生鼠海马神经干细胞增殖的影响【目的】检测BDE-209对体外培养新生鼠神经干细胞增殖的影响【材料与方法】1.传代培养3-4代的新生鼠海马神经干细胞暴露于BDE-209，实验共分5组，空白对照组，DMSO对照组，实验A组：BDE-209浓度为10ug/ml,实验B组：BDE-209浓度为30ug/ml,实验C组：BDE-209浓度为50ug/ml。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液。2.经MTT细胞增殖检测法，分别于24，48，72，96，120小时测定吸光度值3.绘制细胞生长曲线.对A值进行统计学分析.【结果】MTT结果显示细胞生长总趋势上升,随着BDE-209作用剂量的增加，增殖能力下降，经相关分析可见海马神经干细胞增殖能力与一定程度的BDE-209暴露剂量成负相关。【结论】无血清培养基分离培养的新生鼠海马组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力，BDE-209可以导致神经干细胞增殖能力发生改变，随BDE-209浓度增加神经干细胞增殖能力有不同程度的下降,这可能是BDE-209神经毒性的作用机制之一。第三部分BDE-209对体外培养新生鼠海马神经干细胞分化的研究【目的】探讨十溴联苯醚(BDE-209)对体外培养新生鼠海马神经干细胞分化的影响【材料与方法】1.传代培养3-4代的新生鼠海马神经干细胞，在含血清培养基中培养，并暴露于BDE-209，实验共分5组，空白对照组，DMSO对照组，实验A组：BDE-209浓度为10ug/ml,实验B组：BDE-209浓度为30ug/ml,实验C组：BDE-209浓度为50ug/ml。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液。隔天半量换液。2.7天后进行免疫荧光检测，并运用美国Image-Pro-Plus6.0图象分析软件记数NF阳性,GFAP阳性,DAPI阳性细胞数目,计算NF+/DAPI+,GFAP+/ DAPI+比例,并测量NF+细胞突起长度。【结果】NF+细胞比例及NF+细胞突起长度随着BDE-209浓度的增加而减少,GFAP+细胞比例随着BDE-209浓度的增加而增加,存在剂量依赖关系.【结论】BDE-209可以导致神经干细胞分化成神经元的比例发生改变,随BDE-209浓度增加神经干细胞分化成神经元的比例有不同程度的下降,分化成神经元的突起长度也有不同程度的下降。第四部分BDE-209对体外培养新生鼠海马神经干细胞凋亡的研究【目的】观察BDE-209对海马神经干细胞凋亡的影响。【材料与方法】1.传代培养3-4代的新生鼠海马神经干细胞暴露于BDE-209,实验共分5组,空白对照组,DMSO对照组,实验A组:BDE-209浓度为10ug/ml,实验B组:BDE-209浓度为30ug/ml,实验C组:BDE-209浓度为50ug/ml。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液。24h后进行检测。2.采用免疫细胞化学技术检测神经干细胞凋亡。【结果】不同浓度的BDE-209作用24 h后,均可致神经干细胞出现凋亡。实验A,B,C组作用24 h后其凋亡率均有明显增高,表明BDE-209可导致海马神经干细胞凋亡,与对照组相比差异均有显著意义(P < 0.01)。【结论】BDE-209在一定剂量和作用时间内可致海马神经干细胞的凋亡。推测BDE-209在一定浓度范围内可诱导神经干细胞凋亡,这可能是导致仔鼠学习记忆能力下降的作用机制之一。