论文部分内容阅读
氯酚类化合物(chlorophenols，CPs)被应用在为木材保护剂、杀虫剂、除草剂、抗菌剂及工业原料，在环境中普遍存在。目前在各种环境介质、野生生物体内及人体内均检测到了CPs。由于CPs具有慢性毒性、致畸、致癌性以及对野生生物和人体的毒性，美国环保局局将五氯酚(PCP)、2，4，6-三氯酚(2，4，6-TCP)和2，4-二氯酚(2，4-DCP)列为优先控制的污染物。但是氯酚类污染物的内分泌干扰效应以及潜在的分子机制尚不清楚。本文首先以人肾上腺皮质瘤细胞(H295R)为模型，评价了PCP和2，4，6-TCP非受体途径的类固醇合成干扰毒性及潜在的机制。然后，以2，4-DCP为研究对象研究了其对H295R的类固醇合成毒性，在离体细胞研究的基础上，结合活体模型评价了2，4-DCP对斑马鱼下丘脑-脑垂体-性腺轴类固醇合成干扰效应及其造成的生殖毒性。最后，鉴于在环境中氯酚类污染物与重金属共同存在，本文进行了PCP与CuCl2复合暴露对斑马鱼的联合毒性效应的研究。主要结果如下:
1.将低剂量的PCP和TCP暴露于H295R细胞后，研究了细胞中与类固醇激素合成途径的关键基因的表达，发现CYP11A，CYP17，CYP19，3βHSD2，17βHSD4和StAR的mRNA表达水平显著下调，同时睾酮(T)和17β-雌二醇(E2)的含量显著降低，表明氯酚具有干扰细胞类固醇激素合成的内分泌干扰潜力。进一步研究这种内分泌干扰的潜在机制，发现细胞内cAMP的水平显著下降。此外，通过对TCP时间-效应关系的研究，发现类固醇合成重要基因(StAR)和蛋白质的表达与性激素(睾酮:T，雌二醇:E2)的下降和细胞内cAMP浓度下调有直接关系;结果表明PCP通过影响cAMP的含量来调控类固醇激素合成重要基因的表达，最终导致T和E2激素合成下降。
2.2，4-DCP是环境中含量较高的氯酚类污染物。采用了离体与活体相结合的方法，研究了该污染物对斑马鱼的繁殖毒性。经过离体细胞的快速筛选，2，4-DCP可显著降低H295细胞的E2的含量，上调类固醇激素合成中关键基因(CYP11A，CYP17)，3βHSD2，17βHSD4和StAR的mRNA表达水平，同时抑制芳香化酶基因CYP19mRNA的表达。在此基础上，进行了2，4-DCP对斑马鱼的内分泌干扰效应以及繁殖的影响的实验。将斑马鱼成鱼暴露于低剂量的2，4-DCP中，分析了下丘脑-脑垂体-性腺轴(HPGaxis)中与繁殖相关的重要基因的表达，以及鱼肝脏中卵黄蛋白原(VTG)基因的表达，并测定了血清中的性激素含量。结果显示，2，4-DCP暴露后能够影响HPG轴和肝脏关键基因的mRNA的表达基因，改变雌鱼和雄鱼血清中T和E2的含量，降低雌鱼的产卵量和子代的孵化率，表现出繁殖毒性效应。总体结果表明，2，4-DCP暴露后改变了H295R细胞和斑马鱼HPG轴类固醇基因的表达及类固醇激素的生成，最终对斑马鱼造成繁殖毒性。这一实验结果同时也说明离体实验并不能准确的预测活体结果，需要在离体评价的基础上开展完整生命个体的实验。
3.PCP除了具有内分泌干扰效应外，通过产生活性氧并由此引起生物氧化损伤。为了解PCP和重金属的复合毒性效应，开展了低剂量PCP与铜的复合暴露对斑马鱼胚胎的毒性效应研究。将斑马鱼胚胎单独暴露于PCP和铜，同时进行两者的复合暴露，在30μg/LPCP和PCP-CuCl2暴露组，幼鱼的畸形率和存活率显著下降，同时体内ROS显著升高。Tunel染色显示，在30μg/LPCP-CuCl2暴露组，斑马鱼躯干部的凋亡明显。荧光定量PCR对Bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9等凋亡基因的表达情况进行了检测，结果表明在30μg/LPCP和PCP-CuCl2暴露组，特别是30μg/LPCP-CuCl2暴露组除caspase-8外的基因mRNA的表达不同程度上调，同时capspase-9和caspase-3活性显著增加。抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达在30μg/LPCP-CuCl2下调。另外，幼鱼的运动行为也受到了影响，在30μg/LPCP-CuCl2幼鱼运动速度下降明显。实验结果说明，PCP和PCP-CuCl2暴露斑马鱼胚胎能够通过激活caspase诱导斑马鱼的氧化损伤造成凋亡，并对幼鱼的运动行为造成影响。而且，CuCl2与PCP复合暴露后，Cu2+对PCP毒性具有加强效应。