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ZNF580是由本课题组克隆的一种新的锌指蛋白基因,该基因定位于人19号染色体19q13.42,最初是以LDL诱导人脐静脉内皮细胞系ECV304,筛选人主动脉cDNA文库得到的新基因（Genbank注册号:AF184939）,国际人类基因命名委员会命名为ZNF580。ZNF580与Krüppel样锌指转录因子（Krüppel-like factors, Klfs）家族成员类似,其功能仍在进一步研究中,本实验旨在探讨ZNF580在ROS介导的内皮细胞炎症反应中的信号转导机制。目的:以人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926）为体外模型,在典型的活性氧（reactive oxygen species, ROS）——H2O2的作用下,研究人C2H2型锌脂蛋白新基因ZNF580表达情况,分析ZNF580基因表达与氧化应激相关的核转录因子NF-κB转录激活之间的关系,以及ZNF580基因过表达对炎症因子IL-8的释放和单核细胞迁移趋化的影响,进一步揭示ZNF580在ROS介导的内皮细胞炎症反应中的作用。方法:1人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926）,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度下培养。2 H2O2是一个细胞损伤的刺激因素,而LDH（乳酸脱氢酶）是反映细胞膜完整性的重要检测指标。为确定H2O2对内皮细胞的损伤情况,不同浓度H2O2（0-600μM）作用于EA.hy926细胞6h后,提取细胞上清,采用LDH活性检测分析H2O2对内皮细胞的损伤作用。3胰酶消化收集对数生长期EA.hy926细胞,将其悬浮于高糖DMEM细胞培养液中,浓度约为5-6×106/ml,接种到六孔板中2 ml/孔,37℃,5%CO2孵箱培养。在各孔内加H2O2 0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM,每组设三个平行孔。1h后收集细胞,提取总RNA和蛋白,利用半定量RT-PCR、Western blot方法检测不同浓度H2O2对ZNF580表达的影响。4在各孔中加入浓度为100μM的H2O2,每组设三个平行孔,于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h后收集细胞,提取总RNA和蛋白,同样利用半定量RT-PCR、Western blot方法检测不同作用时间的H2O2对ZNF580表达的影响。5内皮细胞经不同处理后,实验分为对照组、H2O2处理组、PDTC干预组和DMSO对照组。各组细胞爬片后固定,免疫细胞化学检测H2O2和特异性抑制剂PDTC对NF-κB亚基p65激活表达的影响。6同样EA.hy926细胞分为不同的处理方式,抽提RNA以及蛋白,利用半定量RT-PCR扩增和Western blot方法检测H2O2是否通过NF-κB信号通路影响和调节ZNF580的表达。7利用pEGFP-ZNF580和pEGFP-C1瞬时转染EA.hy926内皮细胞,获得瞬时过表达ZNF580的EA.hy926细胞。运用倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR以及western-blot技术鉴定转染后ZNF580的表达情况。8运用real-time PCR技术从转录水平检测构建的瞬时高表达ZNF580内皮细胞和正常内皮细胞中白介素-8的表达差异。以ELISA方法从蛋白表达水平检测构建的瞬时高表达ZNF580内皮细胞和正常内皮细胞中白介素-8的表达差异。9人急性单核细胞白血病细胞株（THP-1）,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度下培养。迁移趋化实验分析瞬时高表达ZNF580内皮细胞和正常内皮细胞中IL-8对单核细胞株THP-1迁移率的影响。结果:1不同浓度H2O2作用于EA.hy926细胞, LDH测定结果显示,H2O2浓度为400μM时,LDH的释放量最大。2不同浓度H2O2作用EA.hy926内皮细胞1h后,提取RNA扩增ZNF580片段,以及western-blot观察ZNF580的蛋白表达水平,结果证实,ZNF580在mRNA转录水平和蛋白水平的表达均有增加,并呈现浓度依赖的趋势。（P<0.05）。在浓度为100μM时,ZNF580的表达最高。3浓度为100μM的H2O2作用EA.hy926内皮细胞不同时间后,由RT-PCR和western-blot检测可知ZNF580 mRNA和蛋白水平的表达增加（P<0.05）。在刺激时间为1h时,ZNF580的表达最高。4 H2O2作用可激活NF-κB亚基p65由细胞质转移至细胞核,而特异性抑制剂PDTC存在时,可抑制NF-κB亚基p65在EA.hy926细胞内的核转位。阴性对照DMSO未引起p65核转位。对照组可见棕色颗粒位于细胞质中,细胞核中未见。5 NF-κB信号通路抑制剂PDTC和H2O2共同处理可抑制ZNF580 mRNA及蛋白的上调表达,而单独H2O2的处理可明显上调ZNF580 mRNA及蛋白的表达。6脂质体瞬时转染ZNF580质粒于EA.hy926细胞中,成功构建瞬时高表达ZNF580的EA.hy926细荧光显微镜鉴定转染效率为50%左右,RT-PCR和western-blot鉴定结果显示:与转染pEGFP-C1的细胞相比,转染pEGFP-ZNF580的细胞ZNF580表达量显著升高（P<0.01）。7 Real-time PCR及ELISA分析结果表明,高表达ZNF580的EA.hy926细胞中IL-8的mRNA转录和蛋白表达显著增高。高表达ZNF580的EA.hy926细胞表达的IL-8显著高于正常细胞（P<0.01）。8 Transwell实验检测分析结果表明,高表达ZNF580的EA.hy926细胞对单核细胞THP-1迁移趋化作用有明显的促进作用,与正常组比较结果有统计学意义（P<0.01）。结论:H2O2通过NF-κB信号通路影响ZNF580的表达,进一步促进其下游的炎症因子IL-8的释放,ZNF580在内皮细胞炎症反应中起着重要的作用。该研究阐明了一条与炎症发生相关的信号传导途径,为探讨人C2H2型锌脂蛋白新基因ZNF580功能及其与炎症发生之间的关系提供科学依据。