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我国是世界上最大的天然橡胶消费国,而我国天然橡胶对外依存度却高达80%以上,已超国家战略安全警戒线。面对天然橡胶资源的短缺,新胶源物种的开发迫在眉睫。杜仲橡胶是极具发展潜力的优质天然橡胶资源,但因用于提取杜仲橡胶的原材料叶片和果实中橡胶产量相对较低,造成原料成本较高,严重制约着杜仲橡胶的产业化发展。而揭示杜仲橡胶生物合成过程中的基因调控机理有助于寻找提高杜仲橡胶产量的方法。本研究通过基因克隆、实时荧光定量PCR、亚细胞定位、过量表达及启动子克隆和活性验证等方法对EuHMGR基因的表达模式和功能进行了初步研究,并初步建立了杜仲组织培养体系,为揭示EuHMGR基因在杜仲橡胶生物合成过程中的分子作用机理奠定基础。主要结果如下:(1)克隆得到EuHMGR基因全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。结果表明,EuHMGR基因ORF长1770 bp,编码590个氨基酸,相对分子质量为63 k Da,等电点为6.89;含有2个NADP(H)结合位点GTVGGGT、DAMGMNM及2个HMG-Co A结合位点TTEGCLVA、EMPVGYVQIP,且与已知植物HMGR基因序列相似性达80%以上。(2)分析了EuHMGR基因表达模式与杜仲橡胶合成的相关性。通过分析不同时期不同组织EuHMGR基因的表达模式发现,EuHMGR基因在杜仲果皮和叶片中均有表达,果皮中EuHMGR基因的表达量在幼果时期(4月至5月)达到最大值,而叶片中EuHMGR基因的表达量在7月中旬达到最大值。不同时期果皮和叶片中EuHMGR基因表达模式和含胶增长速率相关性分析显示,果皮中EuHMGR基因的表达模式变化规律与含胶增长速率变化规律在统计学水平呈显著正相关,而在叶片中两者无相关性。(3)确定了EuHMGR基因编码产物作用的位置。通过构建EuHMGR与YFP的融合表达载体,并在烟草中瞬时表达,分析EuHMGR的亚细胞定位。结果表明,EuHMGR定位在内质网上,与MVA途径位于细胞质中相符。(4)EuHMGR功能验证。通过构建过量表达载体35S::EuHMGR,农杆菌介导转化EuTIDS5转基因烟草,筛选得到阳性植株共28株,并对阳性株系的EuTIDS5表达量进行检测,发现EuTIDS5在过量表达EuHMGR烟草中的表达量有不同水平的提高,随后,对阳性株系异戊二烯含量进行测定,结果发现,过量表达植物的异戊二烯含量提高了4-13%,说明EuHMGR的过量表达有利于EuTIDS5基因的表达,从而提高反式异戊二烯的合成和积累。(5)克隆分析了EuHMGR基因的启动子并验证其启动子功能。克隆得到EuHMGR基因上游长2104 bp的片段,序列分析表明,EuHMGR基因启动子含有大量TATA box、CAAT box等保守转录元件,此外,还含有与发育、激素响应、非生物胁迫和生物胁迫等相关的顺式作用元件。构建植物表达载体p EuHMGR::GUS,在烟草中瞬时表达,结果表明,克隆得到的该序列能启动GUS报告基因的正常表达,说明其具有启动子功能。(6)以杜仲无菌苗下胚轴为外植体,初步构建了杜仲组织培养体系。研究发现以MS(无机盐)+B5(有机物)+30 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂为基本培养基,愈伤组织诱导培养基激素配方为:6-BA(1.0 mg/L)+NAA(1.0 mg/L);愈伤组织继代培养基激素配方为:6-BA(0.5 mg/L)+NAA(0.5 mg/L),愈伤组织诱导率达90%以上;分化培养基激素配方为:6-BA(1.0mg/L)+TDZ(1.0 mg/L)+NAA(0-0.15 mg/L),分化率在20%左右。生根培养基采用1/2MS+15 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂为基本培养基,并把切口端在300 mg/L的无菌ABT生根粉溶液中浸泡5s效果最佳。