论文部分内容阅读
产肉性能作为山羊生产中重要经济性状,一直是肉用山羊遗传育种领域的重要研究方向。近年来的研究表明,Akirin1和Akirin2基因在哺乳动物肌肉生长发育过程中发挥重要作用,但是在山羊不同肌肉组织表达差异以及山羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控的作用方面还缺乏系统的认识。本研究以90日龄、180日龄和270日龄天府肉羊的背最长肌、三角肌、臀中肌、臂三头肌、股二头肌、股四头肌、腓肠肌、半膜肌和半腱肌为试验材料,采用荧光定量PCR和蛋白印记杂交检测了Akirin1和Akirin2基因m RNA和蛋白水平的表达差异;以山羊骨骼肌卫星细胞为试验材料,研究了Akirin1和Akirin2基因对山羊骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响;通过RNA-seq技术解析了过表达Akirin1和Akirin2基因对山羊骨骼肌卫星细胞转录组基因表达水平的影响。主要研究结果如下:1.m RNA表达分析发现90 d天府肉羊Akirin1基因在三角肌和臀中肌中表达量较高,半膜肌中表达量最低,Akirin2基因在在三角肌中表达量较高,其余肌肉组织表达量较低;180d天府肉羊Akirin1基因在三角肌和半膜肌中表达量较高,股四头肌中表达量最低,Akirin2基因在在半膜肌中表达量较高,其余肌肉组织表达量较低;270d天府肉羊Akirin1基因在股四头肌、半膜肌和半腱肌中表达量较高,背最长肌中表达量最低,Akirin2基因在在股四头肌和半膜肌中表达量较高,其余肌肉组织表达量较低。背最长肌、三角肌、臀中肌、臂三头肌、股二头肌和半膜肌中Akirin1和Akirin2基因均在180 d呈现高表达;股四头肌中Akirin1和Akirin2基因均在270 d呈现高表达。2.蛋白表达分析发现三个年龄段天府肉羊Akirin1蛋白均在股四头肌、腓肠肌和半膜肌中表达较高,三角肌中表达最低;90 d天府肉羊Akirin2蛋白在背最长肌、股二头肌和股四头肌中表达较高;180 d天府肉羊Akirin2蛋白在股二头肌和股四头肌中表达较高;270 d天府肉羊Akirin2蛋白在股四头肌和半膜肌中表达较高;三个年龄段天府肉羊Akirin2蛋白均在半腱肌中表达最低。3.在山羊骨骼肌卫星细胞分化的过程中过表达Akirin1基因,在转染后的24h和48h分别显著增加(P<0.05)了Myo D和Myf5基因的m RNA表达水平,在转染后的24h到72h Myo G基因的m RNA表达水平缓慢下降;过表达Akirin1基因不能显著增加(P>0.05)My HC基因的m RNA和蛋白表达水平。在山羊骨骼肌卫星细胞增殖的过程中过表达Akirin1基因,在转染后的24h细胞活性显著升高(P<0.05);MEF2s基因家族(MEF2A、MEF2B和MEF2D基因)、IGF2和m TOR基因m RNA表达水平显著增加(P<0.05);m TOR和磷酸化m TOR(phospho-m TOR)蛋白在转染后的24h表达高于对照组;在雷帕霉素和转染Akirin1基因共同处理山羊骨骼肌卫星细胞后的24h,细胞活性在雷帕霉素处理组显著降低(P<0.05),雷帕霉素同时降低了IGF2和m TOR基因的m RNA表达水平以及m TOR和phospho-m TOR(Ser 2448)蛋白表达水平。4.在山羊骨骼肌卫星细胞分化的过程中过表达Akirin2基因,在转染后的24h显著增加(P<0.05)了Myo D和Myo G基因的m RNA表达水平,在转染后的48h到72h Myo D、Myo G和Myf5基因的m RNA表达水平没有显著改变;在转染后的48h显著增加(P<0.05)了My HC基因的m RNA和蛋白表达水平。在山羊骨骼肌卫星细胞增殖的过程中过表达Akirin2基因,在转染后的24h细胞活性显著升高(P<0.05);MEF2s基因家族(MEF2A、MEF2B和MEF2D基因)、IGF2和m TOR基因m RNA表达水平显著增加(P<0.05);m TOR和磷酸化m TOR(phospho-m TOR)蛋白在转染后的24h表达高于对照组;在雷帕霉素和转染Akirin2基因共同处理山羊骨骼肌卫星细胞后的24h,细胞活性在雷帕霉素处理组显著降低(P<0.05),雷帕霉素同时降低了IGF2和m TOR基因的m RNA表达水平以及m TOR和phospho-m TOR(Ser 2448)蛋白表达水平。5.本试验的9测序样品总共获得58 Gb(gigabases)的clean bases(原始数据过滤后的碱基数),其中只能在山羊基因组中比对到唯一位置的clean reads(高质量读段)为92.66%-93.77%。表达差异分析和富集分析发现,过表达Akirin1和Akirin2基因可以使山羊骨骼肌卫星细胞转录组中肌肉生长发育相关基因的表达显著升高(P<0.05),而且差异表达基因还被富集到了肌肉生长发育相关的信号通路中。采用RT-q PCR验证了RNA-seq测序分析出的差异表达基因,结果显示两个实验组合所选择的表达差异基因m RNA表达模式与RNA-seq测序结果一致。本研究通过对Akirin1和Akirin2基因在山羊骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中作用的解析。为进一步研究Akirin1和Akirin2基因在哺乳动物肌肉生长发育过程中的作用提供参考。