【摘 要】
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亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS, EC 6.1.1.4)属于第一类aaRS的A亚类.与它在一个亚类的有缬氨酰-tRNA合成酶(ValRS)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)、甲硫氨酰-tRNA合成酶(MetRS)和半
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亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS, EC 6.1.1.4)属于第一类aaRS的A亚类.与它在一个亚类的有缬氨酰-tRNA合成酶(ValRS)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)、甲硫氨酰-tRNA合成酶(MetRS)和半胱氨酰-tRNA合成酶(CysRS).其中MetRS和CysRS的CP1结构域较小,分别为100和50个氨基酸残基,而其它三种aaRS都有较大的CP1结构域,约250-275个氨基酸残基.大肠杆菌LeuRS是由860个氨基酸组成的单亚基酶,分子量为97.3 kDa.根据第一类aaRS中的A亚类的氨基酸同源序列和嗜热菌(Thermus thermophilus)LeuRS X-光晶体衍射数据分析,大肠杆菌LeuRS的CP1结构域含126至418位共292个残基.通过在CP1结构域构建变种酶并对其性质进行研究,研究证明大肠杆菌的CP1结构域为一个多功能区,它间接地参与 了与ATP和tRNA接受茎的结合,同时与酶的编校功能密切相关.在研究CP1功能时,我们发现一个在LeuRS的 CP1内368-369间插入253-368肽段的插入突变变种LeuRS-C可以与大肠杆菌温度敏感菌KL231互补, 也能够在转化子粗抽液中测定到LeuRS的活力.由于插入的片段含多个氨基酸,占氨基酸总数的13﹪之多,对这一插入变种酶的性质研究成为我们的兴趣所在.但是该变种酶在常规的纯化过程中十分不稳定,成为进一步研究CP1功能的障碍.我们已发表的研究论文表明在N-端接入His标签的天然LeuRS基本对酶活力无影响,基于这种考虑,本文在LeuRS-C基因的编码序列的5上游接入了His标签的编码序列,试图用Ni-NTA亲和层析柱一步纯化该插入变种酶,研究它的性质.本文报道了该插入变种酶基因重组质粒的构建,酶的纯化,酶的热稳定性,二级结构的组成和酶学动力学常数.令人惊奇的是该酶具有全部的两步反应活力,氨基酰化反应中对三种底物的k<,cat>与K<,m>与N-端接有His标签的天然酶的相同.
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